Die Architektur und der Funktionsmechanismus eines Nesselorganells

Dec 19, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3494 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die stechenden Organellen von Quallen, Seeanemonen und anderen Nesseltieren, sogenannte Nematozysten, sind bemerkenswerte zelluläre Waffen, die sowohl zur Jagd als auch zur Verteidigung eingesetzt werden. Nematozysten bestehen aus einer unter Druck stehenden Kapsel, die einen harpunenartigen Faden enthält. Diese Strukturen werden wiederum in spezialisierten Zellen aufgebaut, die als Nematozyten bekannt sind. Beim Auslösen entlädt sich die Kapsel explosionsartig und schleudert den aufgerollten Faden aus, der das Ziel durchsticht und sich schnell ausdehnt, indem er sich in einem Prozess, der als Eversion bezeichnet wird, umstülpt. Aufgrund der strukturellen Komplexität des Fadens und der extremen Entladungsgeschwindigkeit ist die genaue Mechanik des Nematozystenfeuers bislang unbekannt7. Mithilfe einer Kombination aus Live- und hochauflösender Bildgebung, 3D-Elektronenmikroskopie und genetischen Störungen definieren wir hier die schrittweise Abfolge der Nematozystenoperation in der Modellseeanemone Nematostella vectensis. Diese Analyse enthüllt die komplexen biomechanischen Transformationen, die dem Funktionsmechanismus von Nematozysten zugrunde liegen, einer der exquisitesten biologischen Mikromaschinen der Natur. Darüber hinaus wird diese Studie Einblicke in die Form und Funktion verwandter Nesseltierorganellen liefern und als Vorlage für die Gestaltung bioinspirierter Mikrogeräte dienen.

Nesseltiernematozysten sind komplexe subzelluläre Waffen mit hochspezialisierten Formen und Funktionen1,2. Nematozysten sind von Golgi abgeleitete intrazelluläre Organellen, die aus giftigen Fäden bestehen, die in einer unter Druck stehenden Kapsel eingeschlossen sind3,4. Bei Auslösung entlädt sich die Kapsel und wirft ihren Faden als Harpune aus, die in Ziele eindringt und einen Cocktail aus Neurotoxinen abgibt5,6,7,8,9,10. Auf zellulärer Ebene gehört die Nematozystenentladung zu den schnellsten mechanischen Prozessen in der Natur, die bei Hydra-Nematozysten bekanntermaßen innerhalb von 3 Millisekunden abgeschlossen sind11,12. Messungen an Hochgeschwindigkeitsvideos von Hydra-Stenotelen zeigen, dass die Anfangsphase der druckgetriebenen Kapselexplosion und der anschließende Fadenauswurf in nur 700 Nanosekunden erfolgt12. Dieses Anfangsstadium der explosiven Entladung ist vergleichbar mit anderen ultraschnellen Projektilsystemen, die in der Natur vorkommen, wie etwa dem Ausstoß von Pilzsporen, dem Ausstoß von Pollen und dem Ausstoß der ballistischen Organellen von Dinoflagellaten13,14.

Frühere Studien deuten darauf hin, dass die hohe Geschwindigkeit der Nematozystenentladung durch die Ansammlung von osmotischem Druck innerhalb der Kapsel durch eine Matrix aus kationenbindenden Poly-γ-Glutamat-Polymeren (PGs) und die elastisch gedehnte Kapselwand, die durch eine starke Federung Energie freisetzt, angetrieben wird. ähnlicher Mechanismus während der Entladung2,12,15,16. Beim Auslösen, aber vor der Entladung, verdoppelt sich das Volumen der Kapsel aufgrund des schnellen Wassereinstroms17. Dadurch quillt die Matrix osmotisch auf und die Kapselwand wird gedehnt2,18. Diese Energie wird anschließend genutzt, um den Faden mit hoher Geschwindigkeit auszuwerfen, der auf das Zielgewebe trifft und dieses durchdringt. Die späteren Phasen der Nematozystenentladung beinhalten die Verlängerung des Fadens, die langsamer abläuft und in Millisekunden abgeschlossen ist11. Während dieser Phase durchläuft der Nematozystenfaden eine Formveränderung und dreht sich durch einen Prozess namens Eversion um, der durch die Freisetzung sowohl des osmotisch erzeugten Drucks als auch der im Faden gespeicherten elastischen Energie verursacht wird17,19,20. Somit arbeitet die Nematozyste in unterschiedlichen Phasen, die eine anfängliche Phase des Durchstechens des Ziels und spätere Phasen der Eversion zur Bildung eines Lumens umfassen.

Die Eigenschaften von Nematozysten unterscheiden sich erheblich zwischen verschiedenen Nesseltierarten und weisen Unterschiede in der Kapselgröße und der Fadenmorphologie auf. Alle weisen jedoch einen ähnlichen Funktionsmechanismus auf, bei dem ein umstülpbarer Tubulus durch explosiven Auswurf angetrieben wird2,21,22,23. Um die Nematozystenbiologie in einem genetisch kontrollierbaren System zu erforschen, untersuchen wir hier die Funktionsweise des Nematozystenfadens in der Seeanemone Nematostella vectensis. Nematostella beherbergt zwei Arten von Nematozysten: mikrobasische p-Mastigophoren und basitriche Isorhizas, wobei es bei letzteren kurze und lange Varianten gibt24,25. Bei Seeanemonen werden Nematozystenkapseln durch drei apikale Klappen verschlossen, die mit dem Brennfaden verbunden sind26,27,28. Dieser Faden besteht aus zwei unterschiedlichen Unterstrukturen: einem kurzen, starren und faserigen Schaft und einem langen, dünnen Röhrchen, das mit Widerhaken verziert ist17,22. Der Schaft besteht aus drei spiralförmig gewundenen Filamenten und wird zunächst als komprimiertes Projektil ausgestoßen, das das Ziel durchbohrt, und dreht sich später um, um ein Lumen zu bilden, durch das der Rest des Fadens, das Röhrchen, freigesetzt wird17. Obwohl bekannt ist, dass die Schaftumstülpung eine geometrische Umwandlung von einer eng zusammengedrückten Spirale in eine hohle Spritze mit sich bringt, sind die Mechanismen, die diesen Prozess antreiben, kaum verstanden. Darüber hinaus unterscheidet sich die Tubulusumstülpung erheblich von der des dreifach helikalen Schafts, da sich der Tubulus ohne helikale Filamente umstülpt26,29. Die Freisetzung des in der Kapsel gespeicherten Drucks und der elastischen Energie reicht theoretisch aus, um den anfänglichen Ausstoß und die Penetration des Schafts voranzutreiben. Für die weitere Verlängerung des Fadens sind jedoch wahrscheinlich zusätzliche Energiequellen erforderlich5,19,20. Aufgrund der Geschwindigkeit und Komplexität dieser Ereignisse sind die genauen Stadien der Entladung und Umkehrung bislang unklar.

Hier demonstrieren wir die strukturelle Zusammensetzung und die mechanischen Transformationen sowohl des Schafts als auch des Tubulus während verschiedener Phasen der Nematozysten-Entladung in Nematostella und berichten außerdem über den Funktionsmechanismus der Nematozysten-Faden-Unterstrukturen. Unsere Analyse enthüllt die komplexe Struktur und die ausgeklügelten biomechanischen Transformationen, die dem Funktionsmechanismus von Nematozysten zugrunde liegen.

Um die Verteilung von Nesselzellen (Nematozyten) und ihren Nematozysten in Nematostella zu verstehen, haben wir zunächst eine transgene Linie erstellt, die EGFP in Nematozyten unter der Kontrolle der Nematogalectin-Promotorregion exprimiert (Nematogalectin > EGFP; Abb. 1a). Nematogalektin ist ein Hauptbestandteil der Nematozyste und wird während seiner Morphogenese in die Fadenstruktur eingebaut30. Es wird angenommen, dass dieses Protein als Substrat für den Zusammenbau anderer Strukturproteine ​​im Faden fungiert, sodass seine zeitliche Expression ein nützliches Fenster für die Visualisierung von Nematozyten definiert30. Live-Bildgebung transgener Primärpolypen zeigte, dass die Tentakel stark mit EGFP+-Nematozyten besiedelt waren, die die langen Basitrichs trugen (Abb. 1aI). Die Körpersäule war mit der kürzeren Variante zusammen mit einigen p-Mastigophoren besiedelt. Interessanterweise stellten wir fest, dass Nematozyten durch Neuriten-ähnliche Prozesse verbunden waren, die lokale Netzwerke bildeten (Abb. 1aII, Pfeil). Es ist bekannt, dass Nematozyten Synapsen bilden und als Afferenzen oder Effektoren fungieren, aber auch zellautonom agieren können31,32,33,34. Somit könnten die beobachteten Netzwerke bei der Regulierung des kollektiven Verhaltens und der koordinierten Aktivität von Nematozytenpopulationen eine Rolle spielen35. In EGFP+-Nematozyten wurde Fluoreszenz im gesamten Zytoplasma und im Sinnesapparat nachgewiesen, jedoch nicht in der Kapsel (Abb. 1b). Die Kapselwand und der Kapselfaden bestehen teilweise aus Minikollagenen, die durch Vernetzung den Aufbau einer Vielzahl von Strukturfasern ermöglichen36,37,38,39,40,41. Wir nutzten dies, um den Kapselinhalt sichtbar zu machen, indem wir lebende Tiere mit fluoreszierendem TRITC behandelten, das während seiner Reifung in den Nematozystenfaden eingebaut wurde, vermutlich durch eine Reaktion mit Minikollagenen42,43.

a Nematozyten (grün) eines transgenen N. vectensis-Primärpolypen, der EGFP unter der Kontrolle des Nematogalectin-Promotors aI exprimiert. EGFP-Expression an der Tentakelspitze. aII EGFP-Ausdruck in der Körperspalte. Der Pfeil zeigt auf das Netzwerk zellulärer Prozesse, die Nematozyten verbinden. Die Bilder sind repräsentativ für primäre Polypententakel und Körpersäulen von 6 Bruten. b Nahaufnahme eines einzelnen Nematozyten auf der Körpersäule eines Primärpolypen, der EGFP in Nematozyten exprimiert (grün). Der Cnidocil-Apparat (Sensor), der Zellkörper und neuritenähnliche Prozesse werden gezeigt. TRITC (Magenta) beschriftet die Kapsel, den zentral positionierten Schaft und die Falten des Tubulus (n = 10 primäre Polypenkörpersäulen, fünf Experimente). c Nematozystenmorphologien in N. vectensis basierend auf dem Fluoreszenzsignal von eingebautem TRITC. Basitrichous isorhizas-Kapseln (n = 19 kurz, n = 20 lang) mit dicht markiertem Schaft (Pfeil) und gewundenem Tubulus (gestrichelter Pfeil), der in den komprimierten Schaft übergeht (linke und mittlere Tafel). Mikrobasischer p-Mastigophoren-Kapselschaft (n = 10) Schaft (Pfeil) mit seiner markanten V-förmigen Kerbe (rechtes Feld, gestrichelter Pfeil). Bilder, die für gereinigte Nematozysten aus etwa 300 Primärpolypen repräsentativ sind. Maßstabsbalken 1 μm. d Längsschnitt einer Nematozyste mit dicht gewundenen Schaftfilamenten (blau), einem Teil des gewundenen Tubulus (magenta) und den beiden Verbindungsbereichen, dem Kapsel-Schaft-Verbinder und dem Schaft-Tubulus-Verbinder (gelb). Die apikalen Lappen sind in einer teilweise offenen Konformation zu sehen (gestrichelter Kasten). Die entsprechende 3D-Rekonstruktion des Längsschnitts zeigt die Kapsel, den zentralen Schaft (blau), einen Teil des angeschlossenen Tubulus (magenta), Verbindungsbereiche (gelb) und apikale Lappen (gestrichelte Box). e Querschnitt einer Nematozyste mit Darstellung der Kapselwand, des dichten Lamellenschafts und des propellerförmigen Tubulus. (n = 2 Kapselbilder mit vollständigem Volumen von ca. 350 Kapseln, sichtbar in 2 primären Polypenproben.

Bei Nematozysten vom Basitrich-Typ wurde der TRITC-Einbau erst nach der Fadeninvagination beobachtet (ergänzende Abbildung 1a, Pfeile). Im Gegensatz dazu enthielten Nematozyten, die reife Fäden enthielten, kein TRITC (ergänzende Abbildung 1a, gestrichelte Pfeile). Dies deutet darauf hin, dass sich der Farbstoff gezielt in einstülpenden Teilen des Fadens innerhalb der Kapsel ansammelt. Wir fanden heraus, dass der shRNA-vermittelte Abbau des Nematogalectin-ähnlichen Gens Nemve1_232014 zu abnormalen Kapseln führte und die Fadenbildung verhinderte (ergänzende Abbildung 1b). Dies legt nahe, dass Lektine eine entscheidende Rolle bei der Morphogenese von Fäden und Kapseln spielen (ergänzende Abbildung 1b, gestrichelte Pfeile). Wir haben außerdem bestätigt, dass der Abbau zu einer zweifachen Reduzierung der Nemve1_232014-mRNA-Expression durch qPCR führte, was darauf hindeutet, dass dieses Protein für den ordnungsgemäßen Zusammenbau von Faden und Kapsel in großer Menge vorhanden sein muss (ergänzende Abbildung 1c). Mithilfe einer Kombination aus Nematogalectin>EGFP- und TRITC-Farbstoffmarkierung analysierten wir als Nächstes die Architektur des Fadens von seiner Entwicklung bis zu seiner endgültigen Morphologie nach dem Brennen (Abb. 1b, c; Zusatzfilm 1). Im Gegensatz zum dichten Schaft von p-Mastigophoren (Abb. 1c, Pfeile), bei dem die Farbstoffintensität im Vergleich zum Tubulus sehr hoch war, wurde fluoreszierendes TRITC mit ähnlicher Intensität sowohl im Schaft als auch im Tubulus von Basitrichs eingebaut (Abb. 1c, gestrichelte Pfeile). Die einheitlichere Kennzeichnung von Basitrichs und ihre Prävalenz in Primärpolypen veranlassten uns, die Fadenoperation bei diesem Nematozystentyp zu untersuchen.

Um die Struktur von Schaft und Tubulus zu analysieren und dadurch ihre Funktionalität zu bestimmen, führten wir als nächstes eine 3D-Rekonstruktion von ungeladenen Basitrich-Kapseln aus Serienschnitten mittels Rasterelektronenmikroskopie durch (REM; Abb. 1d; Zusatzfilm 2). Wir fanden heraus, dass der komprimierte Schaft aus eng gewickelten Filamenten bestand, die vertikal zur Kapselöffnung ausgerichtet waren, die durch die apikalen Klappen gebildet wurde (Abb. 1d, Kasten). Bei den Filamenten handelte es sich um Verbundstrukturen mit Lamellenstapeln, die aus elektronendichten und elektronendurchlässigen Schichten aufgebaut waren. Diese Ergebnisse bestätigen eine ähnliche Triplett-Lamellenstruktur wie die von Godknecht und Tardent (1988) bei Anemonia sulcata beobachtete Struktur, die feststellten, dass die Spitze des Schafts aus versetzten Lamellen besteht, die in einem kleinen Bereich zusammenlaufen und zur Kapselöffnung zeigen17.

Eine genaue Untersuchung unserer REM-Daten ergab außerdem, dass die Fadenwand, die die Schaftfilamente umhüllt, über eine lose Verbindung zwischen Kapsel und Schaft mit den apikalen Klappen verbunden war. Eine ähnliche Verbindung zwischen Schaft und Tubulus befand sich zwischen dem basalen Ende des Schafts und dem apikalen Ende des Tubulus. Der Tubulus war verdreht und bildete Falten in regelmäßigen Längsabschnitten (Ergänzungsfilme 2, 3). In Kapselquerschnitten wurde beobachtet, dass die Schaftlamellen eng gewunden und komprimiert waren, während der Tubulusquerschnitt eine propellerförmige Struktur aufwies (Abb. 1e; Zusatzfilm 4).

Um die unterschiedlichen Phasen des Fadenbetriebs zu bestimmen, haben wir als nächstes fluoreszierende Hochgeschwindigkeitsfilme von Entladungsereignissen bei TRITC-markierten Tieren aufgezeichnet (Ergänzungsfilme 5–7). Nach der In-situ-Nematozytenstimulation wurde der komprimierte Schaft zunächst als dichtes Projektil ausgestoßen, das sich dann schnell zu einem länglichen Zylinder ausdehnte, durch den der Tubulus austrat (Abb. 2aII – aIV, Pfeile; Zusatzfilm 5). Basierend auf diesen Beobachtungen haben wir drei Hauptphasen der Nematozystenoperation definiert: Schaftentleerung (Phase I), Schaftumstülpung (Phase II) und Tubulusumstülpung (Phase III; Abb. 2, Kasten). Mittels REM haben wir die Ultrastruktur des Entladeschachts visualisiert. Im nicht entladenen Zustand beobachteten wir spärliche Lamellen, die den Bereich schmückten, in dem sich der Schaft zum Kapsel-Schaft-Anschluss hin verjüngte (Abb. 2b, gestrichelter Pfeil). Während der frühen Stadien der Entladung bildete das umgestülpte Kapsel-Schaft-Verbindungsstück eine Schürze um den quer verlaufenden Schaft, wodurch eine doppelwandige Struktur entstand (Abb. 2c, Pfeil), wobei sich der nicht umgestülpte Schaft innerhalb des Verbindungsstücks nach vorne bewegte (Abb. 2c, blau). . Der umgestülpte Kapsel-Schaft-Verbinder war außen mit spärlichen Filamenten bedeckt, die unregelmäßigen Stacheln ähnelten, die aus der im nicht entladenen Zustand beobachteten Umstülpung der Lamellen stammten (Abb. 2c, gestrichelter Pfeil). Serielle SEM-Schnitte erfassten auch einen umgestülpten Verbinder (Abb. 2d, Pfeil), in dem beobachtet werden konnte, wie sich der Tubulus von der Kapsel löste (Abb. 2d, gestrichelter Pfeil; Zusatzfilm 8). Schließlich beobachteten wir in REM-Schnitten eines teilweise entladenen Nematozystenfadens, wie sich der nicht umgestülpte Tubulus innerhalb seiner umgestülpten Fraktion bewegte, der außen mit hohlen Widerhaken verziert war (Abb. 2e, Pfeil; Zusatzfilm 9).

a Live-Bildgebung des Nematozystenausflusses. TRITC-markierte Nematozysten wurden in vivo abgegeben und Bilder wurden in 5-Millisekunden-Intervallen erfasst. aI–aIV Schnappschüsse, die unterschiedliche Phasen zeigen, die der Schaftentladung und der Tubulusverlängerung entsprechen. Hinweis: Die Schachtumkehr (Phase II) war zu schnell, um in dieser Sequenz erfasst zu werden. b Längsschnitt einer Kapsel (C) vor der Entladung, der den nicht umgestülpten Schaft (US) und seine Verjüngung (gestrichelter Pfeil) zum Schaft-Tubulus-Anschluss (gelb, Pfeil), die apikalen Klappen (V-förmig) und den nicht umgestülpten Teil zeigt Tubulus (Magenta). c Längsschnitt einer entladenen Kapsel während der Schaftumstülpung. Die nicht umgestülpten Schaftfilamente (USA, blau), das Kapsel-Schaft-Verbindungsstück (außerhalb der Kapsel, gelb), ein Teil des Tubulus (magenta) und das Schaft-Tubulus-Verbindungsstück (gelb). Die doppelwandige Struktur (Pfeil) und spärlich Es wurden Lamellen auf der Außenseite des Steckers (gestrichelter Pfeil) dargestellt. d Längsschnitt eines umgestülpten Schaft-Kapsel-Verbinders (gelb, Pfeile) und durchquerender nicht umgestülpter Tubulus (UT, magenta, gestrichelter Pfeil). e Längsschnitt eines teilweise umgestülpten Tubulus. Dargestellt sind der umgestülpte Schaft (ES, blau, Pfeil), der Kapsel-Schaft-Anschluss (gelb, gestrichelter Pfeil), Teile des nicht umgestülpten Tubulus (UT, magenta) im Inneren des umgestülpten Tubulus (ET) und Widerhaken (B). f Ein teilweise umgestülpter Nematozystenfaden, der durch TRITC-Inkorporation freigelegt wurde und die Filamente des umgestülpten Schafts (ES), den nicht umgestülpten Tubulus (UT, Mitte) und die Widerhaken (B) zeigt, die den umgestülpten Teil des Tubulus (ET) schmücken. Entsprechende EM-Querschnitte: fI Querschnitt des Tubulus. Beschriftungen geben die umgestülpten und nicht umgestülpten Tubulussegmente mit Widerhaken (B) in der Mitte an. fII Schrägschnitt des teilweise umgestülpten Tubulus mit Tubulussegmenten und Widerhaken an der Außenseite (B). fIII Querschnitt des umgestülpten Schafts (ES) und des quer verlaufenden, nicht umgestülpten Tubulus (UT). Dargestellt sind die elektronendichten und -durchlässigen Schichten der ES-Filamente (Pfeil). g Eine teilweise entladene Nematozyste, gefärbt mit fluoreszierendem Farbstoff-konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin (WGA, Magenta) und TRITC (grün). Vergrößerte Regionen: gI Der Schaft-Tubulus-Verbinder (Pfeil) und der austretende Stülptubulus mit Widerhaken (gestrichelter Pfeil). gII Die Schaftfilamente (grün, Pfeil) und die WGA-beschriftete Fadenwand (magenta). gIII Der Kapsel-Schaft-Anschluss (Pfeil) zeigt die Gewindewand (WGA, Magenta) und den quer verlaufenden, nicht umgestülpten Tubulus (TRITC, grün, gestrichelter Pfeil). h Repräsentative Bilder der verschiedenen Phasen der Fadenumkehr. Die Fluoreszenzfärbung zeigt die geometrischen Transformationen in jeder Phase. Pfeile zeigen den Scheitelpunkt des Gewindes während bestimmter Phasen an.

Um die oben beschriebenen strukturellen Veränderungen besser zu verstehen, analysierten wir als nächstes hochauflösende Bilder von TRITC-markierten Fäden, die sich einer Eversion unterziehen. Mit diesem Ansatz konnten wir die Existenz einer dreifach helikalen Geometrie der abgewickelten Schaftfilamente zusammen mit dem quer verlaufenden, nicht umgestülpten Tubulus nachweisen, die durch die Markierung der Widerhaken verfolgt werden konnte (Abb. 2f). Interessanterweise enthielt die Fadenwand kein TRITC und war in Fluoreszenzbildern unsichtbar, konnte aber in entsprechenden REM-Querschnitten als elektronendurchlässige Schicht gesehen werden, die den nicht umgestülpten Tubulus in seinem kompakten Zustand umschloss (Abb. 2fI, fII). Die hochgeordnete Anordnung der Widerhaken innerhalb des nicht umgestülpten Tubulus weist darauf hin, dass diese Strukturen als Säule gestapelt sind, die in Fluoreszenzbildern als einzelnes Filament erschien (Abb. 2f, fI). Darüber hinaus zeigten REM-Querschnitte durch den Schaft, dass seine Filamente aus Lamellen bestanden, die den quer verlaufenden, nicht umgestülpten Tubulus umschlossen, wie in Fluoreszenzbildern zu sehen ist (Abb. 2f, fIII, Pfeil).

Um die sonst in optischen Bildern unsichtbare Gewindewand sichtbar zu machen, richteten wir unsere Aufmerksamkeit als Nächstes auf andere Komponenten des Gewindes. Zusammen mit Minikollagenen enthalten die Nematozysten von Hydra und Nematostella Glykane und weisen in ihrer Zusammensetzung Ähnlichkeiten mit der extrazellulären Matrix auf44,45,46,47,48. Das Nematozysten-spezifische Lektin, Nematogalectin, fungiert als Gerüst, das die Minikollagene mit Glykanen verbindet und hauptsächlich aus einer nicht sulfatierten Chondroitinhülle besteht30,46,49. In Anbetracht des Vorhandenseins von Lektinen in der Struktur stellten wir die Hypothese auf, dass das Vorhandensein von GAGs mit fluoreszierend markierten zuckerbindenden Lektinen nachgewiesen werden könnte. Daher färbten wir entladene Nematozysten mit fluoreszierendem Farbstoff-konjugiertem Weizenkeimagglutinin (WGA), das für GlcNAc-Ketten selektiv ist, und stellten fest, dass WGA stark an die elektronendurchlässige Fadenwand gebunden ist (Abb. 2g)50. Die gleichzeitige Färbung mit WGA und TRITC zeigte, dass sich das WGA-gefärbte Material nicht gemeinsam mit TRITC lokalisierte, sondern vielmehr ein Laminat mit den TRITC-markierten Strukturen bildete. Schließlich zeigten Bilder von Fäden in einem frühen umgestülpten Zustand, dass der TRITC-markierte Schaft die WGA-markierte Tubuluswand umgab. Die Verbindungsbereiche ohne Filamente oder Widerhaken, die schlecht mit TRITC markiert waren, waren stärker mit fluoreszierendem WGA markiert (Abb. 2gI – gIII).

Wichtig ist, dass wir beobachteten, dass sich die TRITC-Markierung mit den Schaftfilamenten im Durchleuchtungskanal überlappte, was darauf hindeutet, dass die Schaftfasern TRITC-markiertes Material enthalten (ergänzende Abbildung 2a, Pfeile). Im Gegensatz dazu wurde im Innenraum rund um die Wandstruktur eine fluoreszierende WGA-Beschriftung angebracht. Die WGA-Schicht bildete sich wiederholende Lamellen mit den TRITC-markierten Regionen, überlappte jedoch nicht mit TRITC-markiertem Material (Ergänzende Abbildung 2b, c, TRITC, Pfeile; WGA, gestrichelte Pfeile). Durch die Kombination von TRITC- und WGA-Markierung mit Antikörperfärbung des Minikollagens Ncol4 stellten wir fest, dass das TRITC-Signal nur dort in den Fäden der reifen Kapseln vorhanden war, wo der Faden invaginiert ist. TRITC hat reifende Kapseln nicht gekennzeichnet, die mit Nematostella-Minikollagen Ncol4 gefärbt werden können, wie von Zenkert et al. berichtet. (2010)24,25. In den Tentakelspitzen wurden sich entwickelnde Kapseln tief im Ektoderm mit Ncol4-Antikörper gefärbt, während voll ausgereifte Kapseln, die die Oberfläche des Tentakelepithels auskleideten, nicht gefärbt waren (ergänzende Abbildungen 3, 4, Pfeile). Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass der Faden aus zwei Schichten besteht: einer TRITC-markierten Schicht, die die TRITC-detektierbaren Schaftfilamente und Widerhaken bildet, und einer WGA-markierten Schicht, die die gesamte zylindrische Fadenwand bildet, einschließlich der Verbindungsbereiche, der Schaftwand, und Tubuluswand.

Strukturstudien von Nematozystenfäden, die Gelsubstrate durchdringen, deuten darauf hin, dass die Schaftumstülpung an der Schaftspitze beginnt17. Um zu bestimmen, wie sich der Schaft von seinem komprimierten Zustand in eine lockere dreifach helikale Struktur verwandelt, haben wir die frühen Stadien der Entladung erfasst, indem wir Nematostella-Primärpolypen mit einer Lösung behandelt haben, die gleichzeitig die Entladung auslöst und die Proben schnell fixiert24. Die aus Standbildern rekonstruierte Abfolge von Ereignissen zeigte die komplexe geometrische Transformation des Schafts beim Austritt aus der Kapsel in einer spiralförmigen Konfiguration (Abb. 2h und ergänzende Abb. 5a, Pfeile). Wir fanden heraus, dass sich der ausgeworfene Schaft während der Schaftentladung (Phase I) als dichtes Projektil innerhalb des Kapsel-Schaft-Anschlusses weiter vorwärts bewegte, bis der Anschluss seine maximale Länge erreichte. Während der Schaftumstülpung (Phase II) begannen sich die Filamente von der Spitze des Schafts abzuwickeln, drehten sich von innen nach außen und stülpten sich dabei um, während sich das basale Ende des Schafts innerhalb der sich abwickelnden Filamente nach vorne bewegte (ergänzende Abbildung 5b). Die umstülpende Spitze des Schafts wies eine speerspitzenartige Struktur auf (ergänzende Abbildung 5c, Pfeil). Der Tubulus wurde über den Schaft-Tubulus-Verbinder am basalen Ende des Schafts befestigt und so durch das neu gebildete Lumen im Inneren der abgewickelten Schaftfilamente gezogen. Diese Bewegung führte zu einer vollständigen Umstülpung der drei Filamente, wobei das ehemalige apikale Ende des Schafts zu seinem basalen Ende wurde. Schließlich öffnete sich das umgestülpte Schaftlumen und ermöglichte die Bewegung des Schaft-Röhrchen-Verbinders, wodurch Phase III eingeleitet wurde. Das Auftreten von Widerhaken auf der Außenseite des umgestülpten Tubulus markierte eine Grenze zwischen dem Schaft-Tubulus-Verbinder und dem Tubulus selbst und markierte somit den Beginn der Tubulusumstülpung (Abb. 2gI; Abb. 2h, letztes Feld. Ergänzende Abbildung 5a, letztes Feld ). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Wellenumstülpung eine reproduzierbare Reihe physikalischer Transformationen ausführt, die das Abwickeln und Vorwärtsbewegen ihrer Filamente beinhalten.

REM- und Fluoreszenzbilder zeigten Unterschiede in der Zusammensetzung und Struktur zwischen dem dreifach helikalen Faserschaft und dem glatten zylindrischen Tubulus (Abb. 3a, b). Während die Schaftumstülpung durch die Bewegung von drei Filamenten erklärt werden kann, fehlt dem Tubulus eine solche Geometrie und er wird wahrscheinlich durch einen Mechanismus umgestülpt, der das Entfalten und Aufdrehen der Tubuluswand beinhaltet19,29. Live-Bildgebung ergab, dass sich der vorwärtsbewegende Tubulus während der Tubulusverlängerung aufdrehte und in einen zylindrischen Zustand entspannte (Abb. 2aIII – aIV; Abb. 3b, Stufen 1, 2; Zusatzfilm 5). An der umstülpenden Spitze waren die helikalen Windungen des umstülpenden Tubulussegments aufgrund der Konzentration der WGA-Färbung entlang der Widerhakentaschen zu erkennen (Abb. 3c). Im Gegensatz dazu war in einem Bild, das kurz nach Beginn der Tubulus-Eversion aufgenommen wurde, der Tubulus als doppelwandige zylindrische Struktur mit einem Lumen zwischen der nicht umgestülpten und der umgestülpten Wand zu sehen, was darauf hindeutet, dass er sich wahrscheinlich schnell entspannte und entdrehte (Abb. 3d, Pfeile). ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Tubulus-Umstülpung wahrscheinlich in Phasen erfolgt, bei denen sich die propellerartige Form zu einer zylindrischen Konformation aufdreht, und dass die Wirkung des Aufdrehens und Entspannens des umgestülpten Segments den verbleibenden, nicht umgestülpten Tubulus zur distalen Spitze befördert.

ein REM-Bild (n = 6, 2 Experimente) des Schafts (Pfeil), des Röhrchens und der spiralförmig angeordneten Widerhaken (gestrichelter Pfeil). b Fluoreszenzbild eines teilweise umgestülpten Tubulus. Dargestellt sind die Schaftfilamente und Widerhaken (TRITC, grün) und die Fadenwand (WGA, magenta) (n = 10 primäre Polypententakel, 3 Experimente). Maßstabsbalken 2 μm. c Superauflösendes Bild der sich umstülpenden Tubulusspitze (Stadium 1) (n = 20 Fäden eines primären Polypententakels). Dargestellt sind die Widerhaken (TRITC, grün), die Röhrchen (WGA, magenta) und die kombinierten Kanäle. Maßstabsbalken 0,5 μm. d Die Spitze eines sich umstülpenden Tubulus (Stadium 2) (n = 8/30 doppelwandige Fäden eines primären Polypententakels). Dargestellt sind die Tubuluswand (Magenta), ihre doppelwandige Struktur (linkes Mittelfeld, Pfeil) und die Widerhaken (rechtes Mittelfeld, Pfeil). Abbildung von Stufe 2 (rechtes Feld). Maßstabsbalken 1 μm. e Struktur der Tubuluswiderhaken (Pfeile) in Scramble-Kontrolle (n = 0/20 teilweise entladene Fäden eines primären Polypententakels) und v1g243188 (n = 20/20 teilweise entladene Fäden eines primären Polypententakels) shRNA-KD-Proben (gestrichelter Pfeil). ). Die Helligkeit wurde angepasst, um die v1g243188-Threads anzuzeigen. Maßstabsbalken 2 μm. f Auswirkungen des Scrambles und v1g243188-Knockdowns auf die Widerhaken (TRITC, grün) und die Tubuluswand (WGA, magenta). Die Pfeile zeigen die desorganisierten Widerhaken an (n = 25/25 Fäden im Vergleich zu Scramble (n = 0/25 Fäden). Die Helligkeit wurde angepasst, um die v1g243188-Fäden sichtbar zu machen. Repräsentativ für teilweise entladene Fäden aus primären Polypententakeln (Scramble, n = 27 primäre). Polypententakel; v1g243188, n = 25 primäre Polypententakel, n = 5 shRNA-Knockdown-Experimente). Maßstabsbalken 1 μm. g Ein vollständig umgestülpter Faden, markiert mit TRITC und WGA (n = 15 gereinigte und entladene Fäden). Der Pfeil zeigt das Knicken bei a an Distale Tubulusstelle. gI Kapsel-Schaft-Anschluss (Pfeil) und der umgestülpte Schaft (grüner, gestrichelter Pfeil). gII Der Schaft-Tubulus-Anschluss (Pfeil) und der umgestülpte Schaft (gestrichelter Pfeil). gIII Vollständig umgestülpte Tubuluswand (magenta) und die Widerhaken (grün). gIV Spitze des Fadens zeigt die Tubuluswand (magenta, gestrichelter Pfeil), spärlich mit Widerhaken verziert (grün, Pfeil).

Hydra-Spinalin ist ein glycin- und histidinreiches Protein, das in den Wirbelsäulenstrukturen auf der Schaftoberfläche von Hydra-Nematozysten vorhanden ist51,52. Um die Rolle der zentral gestapelten Widerhaken bei der Tubulusumstülpung in Nematostella zu testen, haben wir shRNA53,54 verwendet, um v1g243188 auszuschalten, von dem zuvor berichtet wurde, dass es sich um ein Nematozyten-spezifisches Gen handelt, das ein Spinalin-ähnliches Produkt kodiert55. Eine weitere Analyse legt jedoch nahe, dass v1g243188 einen Fibroin-ähnlichen Faktor kodiert, dessen Sequenzzusammensetzung ziemlich weit von Hydra-Spinalin entfernt ist51,52, und direkte Orthologe von Hydra-Spinalin wurden in Nematostella nicht identifiziert49. Dennoch stellten wir fest, dass der Abbau von v1g243188 zu schwach markierten, dünneren Schaftfilamenten führte und in einigen Fällen die Struktur der Widerhaken sichtbar störte. Der Verlust der TRITC-Intensität deutete darauf hin, dass ein Teil des Farbstoffs auch in die Schaftstruktur eingebaut wurde, entweder direkt oder indirekt aufgrund der Anwesenheit von v1g243188. Während der Niederschlag die Struktur der Widerhaken und ihre Anordnung zerstörte (Abb. 3e, Pfeile), schien dies keinen Einfluss auf den Fadenbetrieb zu haben. Der Verlust von v1g243188 führte jedoch im Vergleich zu den Kontrollen zu einer stärkeren Biegung des Tubulus (Abb. 3e, gestrichelter Pfeil). Diese Beobachtung legt nahe, dass v1g243188 eine Komponente des Threads ist, die eine Rolle für seine strukturelle Integrität, aber nicht für seinen Betrieb spielt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die stereotype helikale Anordnung der Widerhaken und ihre gestapelten Konfigurationen in Proben mit den stärksten Phänotypen gestört waren (Abb. 3f, Pfeil, ergänzende Abb. 6a, Kästchen). Die Messung der TRITC-Intensität der Schaftstrukturen in entladenen Fäden zeigte, dass der TRITC-Einbau nach dem Herunterfahren von v1g243188 verringert wurde, was zu einer Verringerung der mRNA-Spiegel um etwa 65 % führte (ergänzende Abbildung 6d, e). In entladenen Nematozysten schien der vollständig umgestülpte Faden ein isodiametrisches Rohr zu sein, das aus einer WGA-markierten Wand bestand, die mit TRITC-markierten Widerhaken und Schaftfilamenten ausgestattet war, mit Ausnahme der Verbindungsbereiche (Abb. 3g, gestrichelte Kästchen). Die Dichte der Widerhaken nahm vom proximalen zum distalen Ende des Tubulus ab und verzierte den distalen Bereich nur spärlich (Abb. 3gII – gIV). Wir nehmen an, dass die Widerhaken, die vor der Umstülpung innen gestapelt und nach der Umstülpung außen spiralförmig verteilt sind, als Skelett fungieren könnten, das ein weiteres Biegen und Knicken des sich verlängernden Tubulus verhindert. Tatsächlich schien der Tubulus mit der Verringerung der distalen Widerhaken anfälliger für Knicke zu werden als die proximalen Bereiche, die sich in sanften Kurven biegen konnten (Abb. 3g, Pfeil). Interessanterweise beobachteten wir bei der Live-Bildgebung eines sich verlängernden Fadens, dass der Tubulus in seinem mit Widerhaken dichten proximalen Bereich sanfte 180°-Drehungen durchführte (Zusatzfilm 10). Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass es sich bei der Tubulusumstülpung um die Entfaltung der Tubuluswand handelt, in der Widerhaken wahrscheinlich den sich verlängernden Faden strukturell stützen.

Diese Erkenntnisse ermöglichten es uns, ein Modell zu erstellen, das die Schlüsselaspekte der beobachteten geometrischen Umkehrung in drei Phasen beschreibt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Schaftfilamente apikal an den Kapsellappen und basal über Verbindungsbereiche am Tubulus befestigt sind (Abb. 4a). Phase I: Bei der Entladung wird der Schaft zusammen mit dem Kapsel-Schaft-Anschluss, der den Auswurfschaft abdeckt, ausgeworfen. Es entsteht eine doppelwandige Struktur (Abb. 4b, c). Basierend auf Standbildern und Filmen erfolgt die Schaftumstülpung nach dem vollständigen Auswurf des Schafts. Daher gehen wir davon aus, dass der Verbinder seine maximale elastische Spannung aufbaut, wenn der ausgeworfene Schaft seinen maximalen Abstand von der Kapsel erreicht (Abb. 4c). Phase II: Die elastische Belastung des Kapsel-Schaft-Verbindungsstücks erzeugt nach außen gerichtete Kräfte, die auf die Spitze der komprimierten Schaftfilamente ausgeübt werden, was zur Ablösung der Filamente und zur Einleitung des Umstülpungsprozesses aufgrund der Freisetzung der elastischen Spannung innerhalb des Schafts führt (Abb. 4d– g, Einweihung). Nach Abschluss der Sequenz bildet sich im Schaft ein Lumen, das durch die dicken Filamente geschützt wird (Abb. 4h, Ende der Phase II). Phase III: Die letzte Phase beginnt mit der Freigabe des Schaft-Röhrchen-Verbinders, der sich durch Faltung umstülpt und eine doppelwandige Struktur bildet (Abb. 4i). Das nicht umgestülpte Segment des Tubulus tritt dann nach und nach aus der Kapsel aus und bewegt sich durch den umgestülpten Teil des sich verlängernden Fadens (Abb. 4j).

Der Kasten zeigt die Unterstrukturen der Nematozyste. Untere Felder: Vergrößerte Ansichten kritischer Bereiche während bestimmter Phasen. eine nicht entladene Kapsel mit dicht gewundenem Schaft, umgeben von der Schaftwand, zwei Anschlüssen und dem gewundenen Röhrchen. b, c Anfangsstadium der Schachtentladung (Phase I). Dargestellt sind die Vorwärtsbewegung und die Umstülpung des Kapsel-Schaft-Anschlusses (CS), der die ausgeworfenen Schaftfilamente umschließt. Die Pfeile zeigen die Vorwärtsbewegung der Welle an. d–h Der geometrische Umstülpungsmechanismus des Schafts und das Abwickeln der komprimierten Schaftfilamente (Phase II). Pfeile geben die Richtung der Kräfte an, die auf die Spitze der komprimierten Schaftfilamente wirken. z. B. Schritte im Verlauf der Schaftumstülpung. Das Modell zeigt die sich abwickelnden Schaftfilamente und die Vorwärtsbewegung des Schaft-Röhrchen-Verbinders und des Röhrchens. h Die letzte Phase der Schaftumstülpung. Hinweis: Das basale Ende des nicht umgestülpten Schafts wird zum apikalen Ende des umgestülpten Schafts. i–j Der Umstülpungsmechanismus des Schaft-Tubulus-Verbinders und des Tubulus (Phase 3).

In diesem Artikel haben wir die 3D-Organisation der Nematozyste und die Abfolge geometrischer Transformationen beschrieben, die bei ihrer Aktivierung auftreten. Wir schlagen außerdem ein Modell vor, das die spezifischen Mechanismen der Thread-Eversion erklärt. Basierend auf unseren Ergebnissen kommen wir zu dem Schluss, dass die Nematozystenoperation in drei Phasen erfolgt, die eine komplexe Transformation des Schafts und die Verlängerung des Tubulus umfassen, bei der in der Gesamtstruktur gespeicherte Energie in kinetische Energie umgewandelt wird. Der Schaft erfüllt zwei wichtige Funktionen: Erstens dient er als komprimierte Spritze, um in die Zielkutikula einzudringen; Zweitens dient es als Schutztunnel für den Durchgang des dünnen Tubulus.

Die Struktur des Schafts der Anthozoen-Nematozysten weist eine gestaffelte Lamellenstruktur auf, die sich von den spezialisierten Hydra-Stenotelen unterscheidet, die einen pfeilspitzenartig angeordneten Stilett aufweisen3,17,56,57. Godknecht und Tardent haben zuvor vorgeschlagen, dass die versetzte Anordnung der Lamellen, wie sie in den Schäften von Anemonia Sulcata-Nematozysten zu sehen ist, während der Eversion zu einem „hammerbohrartigen“ Aufprall auf einen kleinen Bereich des Ziels führt17. Bei Hydra-Stenotelen trifft die Spitze des Mandrins an einem einzigen Punkt auf das Ziel und durchdringt es2,3,11. Somit ist die Entladungskinetik in den Hydra-Stenotelen um Größenordnungen schneller als der langsamere Prozess der Schaftumkehr, den wir in Nematostella-Nematozysten beobachtet haben11,12.

Der Schaftumstülpungsprozess ähnelt der Mechanik einer Y-förmigen Schleuder, bei der elastische Energie in zwei Bändern gespeichert wird, die an einer Unterlage befestigt sind, die ein Projektil enthält. Beim Loslassen des Polsters erfahren die gedehnten Bänder eine geometrische Umstülpung. Die in den Bändern gespeicherte elastische Energie wandelt sich in kinetische Energie des beschleunigenden Projektils um. Nematozysten nutzen einen ähnlichen Ansatz, speichern jedoch aufgrund des begrenzten Raums innerhalb der Kapsel die für die Schaftumstülpung erforderliche elastische Energie, indem sie drei Filamente biegen und verdrehen und sie an der Kapsel und dem Tubulus befestigen. Die Helices der umgestülpten Filamente weisen im Vergleich zu ihrer nicht umgestülpten Konfiguration einen größeren Radius und eine größere Stufe auf. Daher nimmt die Menge der in den Spiralwindungen gespeicherten elastischen Energie im umgestülpten Zustand ab. Die bei der Schaftumstülpung freigesetzte überschüssige Energie wird möglicherweise für das Lösen der Schaft-Rohr-Verbindung genutzt (Ergänzende Anmerkung 1, Ergänzende Abbildung 7). Die Konnektoren könnten bei der Einleitung der Eversion eine Rolle spielen; Beim Dehnen der Kapsel-Schaft-Verbindung wird die Energie aus der Entladung genutzt, um die Schaftumstülpung einzuleiten, während die Schaft-Röhrchen-Verbindung die elastische Energie der „Schleuder“ überträgt, um die Tubulus-Umstülpung einzuleiten. Der lose Schaft-Röhrchen-Verbinder bildet schnell einen zylindrischen Schlauch, der als Pufferzone für den Übergang des Dreifilamentschafts zum verdrillten Röhrchen dienen könnte.

Die Quelle der treibenden Kraft für die Tubuluspenetration könnte durch den osmotischen Druck und die in der Tubulusstruktur akkumulierten elastischen Kräfte erklärt werden. Es wurde gezeigt, dass die Hydratation geplatzter Kapseln zu einer Extrusion und Aufdrehung des Tubulus ohne Umstülpen führt, was darauf hindeutet, dass der verdrehte Tubulus elastische Energie speichert, um sie später in kinetische Energie umzuwandeln, indem er als Feder fungiert, die durch Entspannung in einen zylindrischen Zustand freigegeben wird19 ,20. Die beim Entspannen sichtbare doppelwandige Struktur (Abb. 3d, zweites Feld, Pfeil) ermöglicht wahrscheinlich den Fluss der PG-Matrix von der Kapsel in das Lumen und lädt so die Kräfte auf, die den Tubulus nach vorne drücken20. Der Vorgang wird wiederholt, bis der Tubulus vollständig verlängert ist oder ein Hindernis erreicht (Zusatzfilme 10, 11). Zusammenfassend zeigt diese Studie die Einsatzfähigkeit der Nematozyste als komplexe und selbstorganisierende biologische Mikromaschine. Wir schlagen vor, dass diese alten und hochentwickelten Organellen ein ideales Modell für biologisch inspirierte Mikrogeräte darstellen, die in verschiedenen Anwendungen von der Medizintechnik bis zur Materialwissenschaft eingesetzt werden könnten.

Die Tiere wurden bei 23 °C in 12 Promille (ppt) künstlichem Meerwasser (ASW; Sea Salt; Instant Ocean) aufgezogen. Die Laichinduktion und das Entgelieren wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt58. Embryonen und Polypen wurden entweder bei Raumtemperatur (23 °C oder 25 °C) kultiviert.

Die transgene Reporterlinie wurde durch Meganuklease-vermittelte Insertion eines Plasmids erzeugt, das EGFP unter der Kontrolle eines nematozytenspezifischen N. vectensis-Nematogalectin-Promotors59,60 enthält. Dieses Konstrukt wurde als Teil eines dualen Reportersystems generiert, das einen neuronalen Reporter mScarlet-I enthält, der hier nicht analysiert wurde und in einer kommenden Veröffentlichung beschrieben wird.

Lebende Nematostella vectensis planulae (2 dpf) durften für kurze Zeit (30 Min.–1 h) mit dem aminreaktiven Rhodaminderivat 5/6-Tetramethylrhodamin-6-isothiocyanat, TRITC (Cayman Chemical, Nr. 19593), reagieren. . Zur Live-Bildgebung der Entladung wurden die Tiere 1 Stunde lang bei einer Endkonzentration von 1 μM inkubiert. Für fixierte Proben wird TRITC bei einer Endkonzentration von 25 μM 1 Stunde lang mit 2dpf-Larven inkubiert. Der fluoreszierende Farbstoff färbte die Tiere ohne erkennbare Toxizität bis zu einer in dieser Studie getesteten Konzentration von 25 μM. Nach der Inkubation wurde der Reaktivfarbstoff durch mehrere Wäschen entfernt. Die Tiere wurden 3–5 Tage lang in sauberem Geschirr in farbstofffreiem Medium überführt, bis reife Nematozyten auftauchten und die unspezifische Hintergrundfluoreszenz im Wesentlichen verschwand. Stammlösungen von 25 mM TRITC wurden hergestellt und gefroren bei –20 °C gelagert und ohne erkennbare Verringerung der chemischen Reaktivität verwendet.

Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) der Topographie (Abb. 3a) wurden Proben gemäß früheren Berichten verarbeitet61. Kurz gesagt, die Proben wurden in 2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M NaCacodylat-Puffer fixiert und mit wässriger Gerbsäure, Osmiumtetroxid, Thiocarbodrazid und dann erneut Osmiumtetroxid (TOTO) gefärbt. Die Proben wurden in einer abgestuften Reihe von Ethanol dehydriert und in einem kritischen Punkttrockner Tousimis Samdri 795 am kritischen Punkt getrocknet, auf Stubs montiert und in einem Hitachi TM4000 Tisch-REM bei 15 kV mit BSE-Detektor abgebildet. Für die Elektronenmikroskopie (EM) der inneren Ultrastruktur wurden die Proben wie oben fixiert, mit einer sekundären Fixierung in 1 % gepuffertem Osmiumtetroxid für 1 Stunde und einer En-bloc-Färbung in 0,5 % wässrigem Uranylacetat, die über Nacht bei 4 °C durchgeführt wurde. Eine abgestufte Reihe von Ethanol wurde zur Dehydratisierung mit Aceton als Übergangslösungsmittel und zur Infiltration in Hard Plus-Harz (Electron Microscopy Sciences) verwendet. Die Proben wurden 48 Stunden lang bei 60 °C ausgehärtet und Serienschnitte wurden bei 50 nm mit einem Diatome 45-Grad-Ultra-Diamantmesser oder einem AT-4 35-Grad-Diamantmesser auf einem Leica UC7 Ultramikrotom geschnitten. Die Schnitte wurden auf Schlitzgittern für die STEM-Bildgebung und auf einem flachen Substrat (Deckglas oder Siliziumchip) für die SEM-Bildgebung gesammelt und mit 4 % Uranylacetat in 70 % Methanol für 4 Minuten und Satos dreifacher Bleifärbung für 5 Minuten nachgefärbt. Schnitte auf flachem Substrat wurden auf Stummel montiert, die Unterseite des Deckglases mit Silberfarbe bemalt, um die Aufladung zu mildern, und alle wurden in einem Leica ACE600-Beschichter mit 4-nm-Kohlenstoff beschichtet. Die Schnitte wurden in einem Zeiss Merlin SEM unter Verwendung des aSTEM- oder 4QBSD-Detektors, SmartSEM (6.0.0, Zeiss) und der Software Atlas 5.2.2.15 (Fibics, Inc.) abgebildet. Serienbilder wurden für die 3D-Modellierung in IMOD (4.9.10)62 ausgerichtet und verfolgt, und 3D-Modelle wurden in Blender 2.92 (Blender Foundation) gerendert. Das Aufrichten vollständig entladener Nematozyten (Abb. 2e) wurde in Fidschi durchgeführt (BildJ)63. Das Bildkomposit der gesamten Nematozystenkapsel (Abb. 1d) und die Falschfärbung wurden in Photoshop 2021 (Adobe, Inc.) erstellt.

Die Nematozysten der mit TRITC behandelten Tiere wurden durch Senkung des pH-Werts des Mediums mit Essigsäure entfernt. Die Nematozysten entladen sich in vivo, wenn das Medium sauer wird. Primäre Polypen wurden in Glasbodenschalen immobilisiert, indem sie mithilfe von Silikondichtmittel zwischen einen Glasobjektträger und den Boden einer Glasbodenschale gelegt wurden. Die Bilder wurden nach tropfenweiser Zugabe von Eisessig (37 %) zum ASW aufgenommen, was die Kapselentladung auslöst, wenn der pH-Wert im Medium ausreichend unter einen bestimmten Schwellenwert sinkt. Live-Bilder der Reifung und Entladung der Nematozysten wurden mit dem Yokogawa CSU-w1 Spinning-Disk-System auf einer Nikon Ti2-Plattform mit 100-fachem Objektiv aufgezeichnet.

Mit TRITC behandelte Primärpolypen wurden über Nacht in Lavdovskis Fixiermittel (Ethanol∶Formaldehyd∶Essigsäure∶dH2O; 50∶10∶4∶36) fixiert24. Das Fixiermittel wurde entfernt und die Proben wurden fünfmal mit 1 ml PBS pH 7,4 gewaschen, um das Fixiermittel zu entfernen. Die Proben wurden mit 0,1 % Triton-X100 in PBS, pH 7,4, 15 Minuten lang permeabilisiert. Nach mehreren zusätzlichen Wäschen in PBST (0,1 % Tween 20 in PBS, pH 7,4) wurden die Polypen zunächst 1 Stunde lang blockiert und über Nacht bei 4 °C mit NvNCol-4 (1:500) in PBST, ergänzt mit 10 % Ziege, inkubiert Serum. Minikollagen und Ncol424 Der Anti-NvNcol-4-Antikörper gegen Nematostella vectensis Minikollagen-NvNcol-4-Protein (Kaninchen, Verdünnung 1:500) war ein freundliches Geschenk von Suat Ozbek, Universität Heidelberg. Die Polypen wurden dreimal in PBST, ergänzt mit 10 % Ziegenserum, gewaschen und mit Alexa Fluor 647-gekoppeltem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), Verdünnung 1:500, Thermo Fisher, Kat.-Nr.: A21245, Lot: 1981173) und WGA-OregonGreen (Verdünnung 1:500, Invitrogen Kat.-Nr.: W7024B, Lot: 2298084) über Nacht in PBST, ergänzt mit 10 % Ziegenserum. Danach wurden die Polypen mehrmals in PBS gewaschen und über Nacht in 90 % PBS/Glycerin inkubiert. Die Polypen wurden auf einen Glasobjektträger übertragen und mit ProLong Glass Antifade-Eindeckmedium (ThermoFisher, Kat.-Nr.: P36982) auf einem Glasobjektträger montiert. Fluoreszenzbilder wurden mit Yokogawa CSU-w1 auf einer Nikon Ti2-Plattform aufgenommen. Hochauflösende konfokale Fluoreszenzbilder wurden mit dem Zeiss LSM780 im Airyscan-Modus aufgenommen.

In Abb. 2f wurden mit TRITC behandelte Primärpolypen über Nacht in Lavdovskis Fixiermittel (Ethanol∶Formaldehyd∶Essigsäure∶dH2O; 50∶10∶4∶36) fixiert24,25. Nach mehreren Wäschen wurden die Polypen auf PBS/Glycerin (PBS) übertragen und über Nacht inkubiert. Die Polypen wurden auf einen Objektträger übertragen und mit ProLong Glass Antifade Mountant (ThermoFisher, Kat.-Nr.: P36982) befestigt. Die Polypen wurden auf den Objektträgern ausgebreitet. Die markierten Tentakel mit teilweise entladenen Nematozysten wurden entweder intakt abgebildet oder mit dem Abdeckobjektträger zerdrückt, um die Kapseln vom Gewebe zu lösen. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit dem Zeiss LSM780 im Airyscan-Modus durchgeführt.

Mit TRITC behandelte Primärpolypen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, aufgetaut und manuell mit einem Plastikstößel mazeriert. Die Proben wurden in 1 ml Percoll (50 %, v/v; Sigma Kat.-Nr.: P1644) in 300 mM Saccharose, ergänzt mit 0,01 % Tween20, suspendiert, um ein Anhaften an den Mikrozentrifugenröhrchen zu verhindern. Durch Auf- und Abpipettieren wird das Gewebe weiter aufgeschlossen. Man lässt die Mischung 30 Minuten lang auf Eis absetzen und zentrifugiert sie 15 Minuten lang bei 950 g. Das Pellet wird zweimal mit PBS mit 0,01 % Tween-20 gewaschen und in Nematozysten-Entladungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM CaCl2) resuspendiert. Die Entladung wurde durch Zugabe von 1 mM DTT eingeleitet und 30 Minuten lang inkubiert. Nach 30-minütiger Inkubation wurde 1 μg/ml mit OregonGreen konjugiertes Weizenkeimagglutinin (Verdünnung 1:500, Invitrogen, Kat.-Nr. W7024B, Chargennummer: 2298084) in das Röhrchen gegeben und 1 Stunde lang inkubiert. Die gefärbten Proben wurden zweimal mit PBST gewaschen und 5 Minuten bei 1000 × g zentrifugiert. Ein loses Pellet wird sichtbar und in PBST suspendiert. 5-μl-Aliquots wurden auf Glasobjektträgern verteilt und mit ProLong Glass Antifade Mountant fixiert. Die Bilder wurden mit dem Yokogawa CSU-W1 Spinning-Disk-System auf einer Nikon Ti2-Plattform mit 100-fachem Objektiv aufgenommen.

Die kurze Haarnadel-RNA, die auf die mutmaßlichen Nematostella-Gene v1g243188 und Nemve1_232014 abzielt, wurde durch T7-Polymerasereaktion synthetisiert und mit dem Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit (Zymo Research, Kat.-Nr.: R2072) gereinigt. Gereinigte shRNA wurde in unbefruchteten Eiern in einer Konzentration von 1 μg/μl mikroinjiziert oder in einer Konzentration von ~600 ng/μl bis 1 μg/μl gemäß den zuvor beschriebenen Methoden elektroporiert53,54. Die Eier wurden mit Spermien von Wildtyp- oder transgenen Männchen befruchtet. Nach der Befruchtung wurden die Embryonen zwei Tage lang inkubiert und mit TRITC behandelt. Die folgenden Primer (Integrated DNA Technologies) wurden angelagert und als Duplex-Matrizen für die Kurzhaarnadel-RNA-Synthese verwendet:

v1g243188 Weiterleiten: TAATACGACTCACTATAGCGGTGGACTCTACTTATTTTCAAGAGAAATAAGTAGAGTCCACCGCTT und

v1g243188 Umgekehrt: AAGCGGTGGACTCTACTTATTTCTCTTGAAAATAAGTAGAGTCCACCGCTATAGTGAGTCGTATTA

Nemve1_232014 Weiterleiten:

TAATACGACTCACTATAGGCATCGTTACCAGTACAATTCAAGAGATTGTACTGGTAACGATGCCTT

Nemve1_232014 Rückseite:

AAGGCATCGTTACCAGTACAATCTCTTGAATTGTACTGGTAACGATGCCTATAGTGAGTCGTATTA

Vorwärts kriechen:

TAATACGACTCACTATAGCAACACGCAGAGTCGTAATTCAAGAGATTACGACTCTGCTGTGTTGCTT

Scramble Reverse:

AAGCAACACGCAGAGTCGTAATCTCTTGAATTACGACTCTGCGTGTTGCTATAGTGAGTCGTATTA.

Elektroporierte Tiere wurden in TRIzol-Reagenz (Ambion, Ref: 15596018; Lot-Nr. 254707) gelöst und die RNA wurde mit dem Direct-zol RNA Mini Prep Plus-Kit (Zymo Research, Kat.-Nr.: R2072) gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Nach der RNA-Extraktion cDNA wurde mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Kat.-Nr.: 4382406, Lot-Nr. 0124432) synthetisiert. Schließlich wurde qRT-PCR mit Luna Universal qPCR-Mastermix (NEB, Kat.-Nr.: M3003L) durchgeführt , Lot-Nr.: 10133023) unter Verwendung der folgenden Primer (Integrated DNA Technologies):

GAPDH

Vorwärts 5′-GGACCAAGTGCCAAGAACTG-3′

Rückwärts 5′-GGAATGCCATACCCGTCAG-3′

v1g243188

Vorwärts 5′-CCGCCTTATCCTTCGTTGAT-3′

Reverse 5′-ATGCGGTGGACTCTACTTATTG

Nemve1_232014

Vorwärts 5′-TGTGAAGGAACGACGATGTG-3′

Reverse 5′-GACCGTTGATGACCTCGATAC-

Quantitative RT-PCR-Daten wurden wie zuvor beschrieben analysiert64.

Die gesamte Bildanalyse wurde mit Fiji (ImageJ, 2.1.0/1.53c) durchgeführt. Helligkeit, Kontrast und Gamma wurden manuell angepasst. Der Hintergrund wurde mit dem Werkzeug „Hintergrund subtrahieren“ in Fidschi subtrahiert. In der ergänzenden Abbildung 6b, c wurde die Helligkeit erhöht, um die Fadenstruktur besser sichtbar zu machen. Die Längenmessungen für die nicht entladenen und entladenen Kapseln und Röhrchen wurden manuell mit dem manuellen Freihand-Tracing-Tool von Fiji (ImageJ) durchgeführt und die Ergebnisse wurden in den Zusatzinformationen besprochen. Die mittlere Signalintensität, Fläche und Länge der Objekte wurden in Fidschi (ImageJ) mithilfe eines Messwerkzeugs erfasst. Die Ergebnisse wurden in den in den Zusatzinformationen beschriebenen Schätzungen verwendet. Die Schätzungen wurden in Wolfram Mathematica (12.0) durchgeführt. In Abb. 4 wurde das Modell in Blender (2.93) erstellt.

Für die EM-Aufnahmen in Abb. In den Abbildungen 1d, e und 2b–e wurden Serienschnitte von zwei verschiedenen Tieren aufgenommen. Von 350 Kapseln, die in den Volumina beider Tiere beobachtet wurden, haben wir hochauflösende Bilder von drei vollständigen Volumina nicht entladener Kapseln und zwei Teilvolumina nicht entladener Kapseln aufgenommen; ein vollständiges Volumen einer entladenen Kapsel in Phase 1, zwei vollständige Volumina entladener Kapseln in Phase 2 und drei Teilvolumina und ein vollständiges Volumen entladener Kapseln in Phase 3.

Zur qRT-PCR-Verifizierung des Zielgen-Knockdowns wurden drei unabhängige Knockdown-Experimente mit ca. 200 Polypen pro Probe durchgeführt. Jede Probe wurde dreifach analysiert. Mit GraphPad Prism (9.3.1) wurden Diagramme erstellt und statistische Analysen durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines zweiseitigen, ungepaarten Studenten-T-Tests ermittelt. Die p-Werte sind in den Legenden der Abbildungen angegeben. Cohens d wurde verwendet, um die Effektgröße für alle T-Test-Analysen zu bewerten (mittlere Differenz zwischen den Gruppen dividiert durch die gepoolte Standardabweichung).

Repräsentative Fluoreszenzbilder teilweise entladener Nematozysten wurden von den Tentakeln TRITC-behandelter Tiere aufgenommen, die mit Lavdovskis Reagenz fixiert waren, mit identischen Ergebnissen in 10 unabhängigen Markierungs- und Entladungsexperimenten. Abbildung 1a ist ein repräsentatives Bild der Transgenexpression, die bei Tieren aus sechs unabhängigen Laichen beobachtet wurde. In Abb. 1b waren der Nematozyten und seine Kapsel repräsentativ für Körpersäulen-Nematozyten (n = 10 primäre Polypenkörpersäulen, 5 Experimente). In Abb. 1c waren die Kapseln repräsentative Fluoreszenzbilder mit hoher Vergrößerung von kleinen (n = 19) und großen (n = 20) Basitrichen und p-Mastigophoren (n = 10), die aus ~ 200 Primärpolypen gereinigt wurden. Die Bildsequenz in Abb. 2a und die Zusatzvideos 5–7, 10 und 11 wurden aus drei unabhängigen Live-Entladungsexperimenten aufgezeichnet.

Abbildung 2f und die ergänzende Abbildung 2 waren repräsentative hochauflösende Bilder des Schafts und der Röhrchen teilweise entladener Fäden aus vier unabhängigen Experimenten. In Abb. 2g und h wurde die Entladungssequenz aus den repräsentativen Bildern teilweise entladener Fäden rekonstruiert (n = 67 teilweise entladene Fäden aus primären Polypententakeln, drei Experimente). Abbildung 3a ist ein repräsentatives REM-Bild teilweise entladener Fäden (n = 6). Abbildung 3b ist ein repräsentatives Bild von WGA- und TRITC-gefärbten primären Polypententakeln, die mit Lavdovskis Reagenz fixiert wurden (n = 10 primäre Polypententakel, drei Experimente). Die Abbildungen 3c, d waren repräsentativ für Fäden der Stufe 1 (Abb. 3c, n = 20) und doppelwandige Fäden der Stufe 2 (Abb. 3d, n = 8) unter den sichtbaren Fäden an einem primären Polypententakel. Abbildung 3e, f sind repräsentative Fluoreszenzbilder, die von teilweise entladenen primären Polypententakeln von Scramble-Kontroll-shRNA (n = 0/25 Fäden von 1/27 Tentakeln) und v1g243188-shRNA (n = 25/25 Fäden von 1/25 Tentakeln) von 5 aufgenommen wurden Knockdown-Experimente. Abbildung 3g war ein repräsentatives Bild gereinigter und vollständig entladener Fäden von ca. 300 Primärpolypen (n = 15 Fäden).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

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Die Korrespondenz und Materialanfragen sollten an [email protected] gerichtet werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Alejandro Sánchez Alvarado, Jay Unruh, Kausik Si, Whitney Leach, Eric Hill und Subramanian Ramanathan für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Wir danken Molly Simmons für die Illustrationen des Modells. Wir danken Xia Zhao und Morgan Harwood (Electron Microscopy Core) für die Unterstützung bei Experimenten und der Stowers Reptiles and Aquatics Facility für die Tierhaltung. Wir danken Suat Ozbek, Universität Heidelberg, für den Minikollagen-Ncol4-Antikörper und Ruohan Zhong für die Hilfe bei der Erzeugung der transgenen Tiere. Die Arbeit wurde vom Stowers Institute for Medical Research finanziert.

Stowers Institute for Medical Research, Kansas City, MO, USA

Ahmet Karabulut, Melainia McClain, Boris Rubinstein, Keith Z. Sabin, Sean A. McKinney und Matthew C. Gibson

Abteilung für Anatomie und Zellbiologie, The University of Kansas School of Medicine, Kansas City, KS, USA

Matthew C. Gibson

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AK und MCG haben diese Studie konzipiert. AK, BR und MCG haben das Manuskript geschrieben. AK, SMC, MMKZS und BR führten die Experimente durch und analysierten die Daten.

Korrespondenz mit Ahmet Karabulut oder Matthew C. Gibson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Nicholas Money und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Karabulut, A., McClain, M., Rubinstein, B. et al. Die Architektur und der Funktionsmechanismus eines Nesselorganells. Nat Commun 13, 3494 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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Eingegangen: 29. September 2021

Angenommen: 02. Juni 2022

Veröffentlicht: 17. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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