Zufällig kompatible Proteinoberflächen ermöglichten die allosterische Kontrolle beim Lichtschutz von Cyanobakterien

May 20, 2023

Nature Ecology & Evolution Band 7, Seiten 756–767 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Hochspezifische Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind eine Grundvoraussetzung für Leben, doch wie sie sich entwickeln, bleibt ein ungelöstes Problem. Insbesondere Interaktionen zwischen zunächst nicht verwandten Proteinen erfordern die Entwicklung passender Oberflächen. Es ist unklar, ob solche Oberflächenkompatibilitäten nur durch Selektion in kleinen Schritten aufgebaut werden können oder ob sie auch zufällig entstehen können. Hier verwendeten wir molekulare Phylogenetik, Rekonstruktion der Ahnensequenz und biophysikalische Charakterisierung wiederauferstandener Proteine, um die Entwicklung einer allosterischen Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen nachzuvollziehen, die im Photoschutzsystem der Cyanobakterien wirken. Wir zeigen, dass diese Wechselwirkung zwischen dem Orangen-Carotinoid-Protein (OCP) und seinem nicht verwandten Regulator, dem Fluoreszenz-Recovery-Protein (FRP), entstand, als Cyanobakterien einen Vorläufer von FRP horizontal akquirierten. Die Vorläufer von FRP konnten bereits mit OCP interagieren und es regulieren, noch bevor diese Proteine ​​erstmals in einem angestammten Cyanobakterium aufeinander trafen. Die OCP-FRP-Wechselwirkung nutzt eine alte Dimerschnittstelle in OCP, die ebenfalls vor der Rekrutierung von FRP in das Lichtschutzsystem existiert. Gemeinsam zeigt unsere Arbeit, wie die Evolution komplexe Regulierungssysteme leicht aus bereits vorhandenen Komponenten formen kann.

Allosterische Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind eine allgegenwärtige Form der biochemischen Regulation, bei der die aktive Stelle eines Proteins durch die Bindung eines anderen Proteins an eine distale Stelle beeinflusst wird1. Wie sich solche Interaktionen entwickeln, ist ein ungelöstes Problem in der evolutionären Biochemie. Es erfordert, dass beide Proteine ​​(der Regulator und das Ziel) eine passende Schnittstelle sowie einen Mechanismus entwickeln, der die Bindung des Regulators in eine Veränderung am aktiven Zentrum des Zielproteins umwandelt. Wenn sich alle an dieser Schnittstelle und dem Übertragungsmechanismus beteiligten Reste de novo entwickeln müssten, würde der Aufbau einer solchen Wechselwirkung mehrere Substitutionen in beiden Proteinen erfordern. Da es sehr unwahrscheinlich ist, dass lange genetische Verläufe mit mehreren Substitutionen in mehreren Proteinen durch zufällige genetische Drift fixiert werden, wird normalerweise angenommen, dass bestehende Interaktionen in inkrementellen Mutationsschritten aufgebaut wurden. Jeder Schritt würde einen einzelnen interagierenden Rest hinzufügen und durch natürliche Selektion, die direkt auf eine mit der Interaktion verbundene Funktion einwirkt, zur Fixierung getrieben werden2. In einigen Proteinsystemen existierten jedoch zufällig bereits Schnittstellen oder allosterische Wege in einem der beiden Partner3,4,5,6. Dies deutet darauf hin, dass einige Aspekte dieser Interaktionen zufällig entstanden sind und dann von anderen, später entstandenen Komponenten ausgenutzt wurden.

Es bleibt unklar, inwieweit eine direkte Selektion erforderlich ist, um diese verbleibenden Komponenten einer Interaktion zu gestalten, beispielsweise die Interaktionsoberfläche eines neuen Regulators, der eine bereits vorhandene Oberfläche auf seinem Ziel ausnutzt. Im Prinzip könnten diese Merkmale auch völlig zufällig sein, wenn sie ursprünglich aus Gründen behoben wurden, die nichts mit der Interaktion zu tun haben. In allen gut untersuchten Fällen können wir diese Frage nicht beantworten, da beide Komponenten aus demselben Genom stammen, in dem sich das Ziel und der Regulator immer begegnet wären, sodass die Selektion möglicherweise dazu beigetragen hat, den Regulator an sein neues Ziel anzupassen3, 4,5,6. Ob eine biologisch bedeutsame Interaktion jemals wirklich zufällig zustande kam, bleibt daher unbekannt.

Hier gehen wir dieses Problem an, indem wir die Entwicklung einer allosterischen Wechselwirkung im Photoschutzsystem der Cyanobakterien untersuchen7,8. Photoaktive Organismen müssen sich vor starker Lichteinstrahlung schützen, die zu Lichtschäden führt. In Cyanobakterien wird dieser Schutz durch das Orange-Carotinoid-Protein (OCP) vermittelt9,10, ein photoaktiver Lichtintensitätssensor mit einem symmetrisch in seine beiden Domänen eingebetteten Carotinoid, der in der Lage ist, die Konformation von einem inaktiven Orange (OCPO) zu einem aktivierten Rot zu ändern Zustand (OCPR) unter starken Lichtbedingungen11. Aktiviertes OCPR bindet an den lichtsammelnden Antennenkomplex der Cyanobakterien, das Phycobilisom, um überschüssige Phycobilisom-Anregung als Wärme abzuleiten11,12. Zwei OCP-Paraloge (OCP2 und OCPx) können sich im Dunkeln passiv vom Phycobilisom lösen und in OCPO zurückkehren11,13. Das häufigste Paralog OCP1 beruht jedoch auf einer allosterischen Regulation für die Photowiederherstellung: OCP1 interagiert mit dem Fluoreszenz-Recovery-Protein (FRP), einem kleinen dimeren Regulator, der die Interaktion mit dem Phycobilisom beendet und die Rückumwandlung von OCPR stark beschleunigt in den orangefarbenen Ruhezustand14,15 (Abb. 1a). Obwohl kürzlich die wahrscheinliche Entwicklung von OCP aus nicht photoschaltbaren Vorläufern nachgewiesen wurde16, ist noch nicht bekannt, wie FRP als neuer allosterischer Regulator in das Photoschutzsystem der Cyanobakterien rekrutiert wurde.

a, Mechanismus des Cyanobakterien-exklusiven, OCP-vermittelten Lichtschutzes mit allosterischer Kontrolle durch FRP (Cyan) in OCP1-Paralogen. Verwendete Strukturen (PDB-IDs): 7EXT (Ref. 57), 3MG1 (Ref. 58), 4JDX (Ref. 25) und 7SC9 (Ref. 29). PBS, Phykosbilisom. b, Reduzierte ML-Phylogenie von OCP-Paralogen mit angegebener relativer Erholungsgeschwindigkeit nach der Photokonversion und rekonstruierte Ahnenproteine ​​(Anc) ausgewählter Kladen. Cyanobakterielle CTDHs sind die Fremdgruppe. Fettgedruckte Zahlen zählen Taxa der ausgewiesenen OCP-Paraloge. Kursive Zahlen sind Felsenstein-Bootstrap-Wahrscheinlichkeiten von 100 Replikaten. Die Verzweigungslängen stellen die durchschnittlichen Substitutionen pro Standort dar. Der vollständige Baum ist in Extended Data Abb. 1 dargestellt. c, Ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektren des inaktiven orangen und aktiven roten Zustands von AncOCPall im Vergleich zu vorhandenem OCP1 aus Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3; gestrichelte Linien). d–f, Erholung nach der Photokonvertierung angestammter OCPs bei 20 °C mit (cyan) oder ohne SYNY3 FRP (schwarz) und jeweilige mittlere Erholungszeitkonstanten (τ) mit sd von drei unabhängigen Replikaten: AncOCPall (d), AncOCP1&2 (z ) und AncOCP1 (f). Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt.

Um die evolutionären Ursprünge der allosterischen Interaktion von OCP1 mit FRP nachzuvollziehen, versuchten wir zunächst zu verstehen, wie sich OCP-Paraloge entwickelten und wann sie die Fähigkeit erlangten, durch FRP reguliert zu werden. Kürzlich wurde gezeigt, dass sich das erste OCP wahrscheinlich über ein Genfusionsereignis zweier kleiner Proteine ​​​​entwickelte und dass eine Linker-Addition für Photoschaltbarkeit sorgte16. Homologe dieser Einzeldomänenproteine ​​sind immer noch in vorhandenen Cyanobakterien zu finden und wurden als helikale Carotinoidproteine ​​(HCPs) und C-terminale domänenähnliche Homologe (CTDHs) bezeichnet, die eine gemeinsame Faltung von Kerntransportfaktor-2-Proteinen (NTF2) aufweisen17 . Wir haben zunächst eine Maximum-Likelihood-Phylogenie (ML) von OCP-Proteinen abgeleitet, indem wir CTDH-Sequenzen von Cyanobakterien als Außengruppe zur Wurzelbildung unseres Baums verwendet haben (Abb. 1b und erweiterte Daten, Abb. 1). Wir beschreiben weiter eine alternative Wurzelbildung unter Verwendung von HCP-Sequenzen in Abb. 2 der erweiterten Daten. Unser phylogenetischer Baum ist praktisch identisch mit einem kürzlich veröffentlichten Baum16, wobei OCPx, OCP2 und OCP1 jeweils gut unterstützte monophyletische Gruppen bilden. OCP1 und OCP2 sind Schwestergruppen, unter Ausschluss aller anderen OCPs. Zwei weitere nicht charakterisierte Kladen verzweigen zwischen der OCPx-Gruppe und OCP1 und OCP2, die zusätzliche OCPx sein oder separate Paraloge darstellen könnten.

Wir verwendeten die Rekonstruktion der Ahnensequenz, um die Aminosäuresequenzen der OCPs der Vorfahren an den inneren Knoten unseres Baums und entlang der Linie zum FRP-regulierten OCP1 abzuleiten. Wir konzentrierten uns auf drei Proteine ​​vom letzten gemeinsamen Vorfahren (LCA) aller vorhandenen OCP (AncOCPall) über die LCA der OCP1- und OCP2-Paraloge (AncOCP1&2) bis zur LCA des vorhandenen OCP1 (AncOCP1), die mit durchschnittlichen hinteren Wahrscheinlichkeiten rekonstruiert wurden Stellen zwischen 0,92 und 0,96 (Abb. 1b und erweiterte Daten Abb. 3a – e). Wir haben diese angestammten OCP-Proteine ​​heterolog in Escherichia coli wiederbelebt und sie für die In-vitro-Charakterisierung gereinigt. Alle OCPs der Vorfahren sind fotoschaltbare Lichtintensitätssensoren mit einem gebundenen Echinenon als bevorzugtem Carotinoid (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 4a – h). AncOCPall zeigt eine moderate Zeitkonstante für die Rückumwandlung von OCPR in OCPO von 166 ± 10 s (ähnlich wie vorhandenes OCP2, Lit. 16). Die Erholungskonstante sinkt in AncOCP1 und 2 auf 20 ± 1 s (schneller als vorhandene OCPs), steigt jedoch in AncOCP1 drastisch auf 314 ± 8 s (wie in vorhandenem OCP1) (Abb. 1d – f und erweiterte Daten Abb. 4i – l). Unsere Daten zeigen, dass die langsame Fotowiederherstellung ein Merkmal ist, das sich entlang der Verzweigung zu OCP1 entwickelt hat, was mit der Theorie übereinstimmt, dass nur OCP1-Paraloge FRP für eine allosterisch beschleunigte Wiederherstellung benötigen.

Als nächstes testeten wir die Wirkung eines vorhandenen FRP aus Synechocystis sp. PCC 6803 über die Erholungszeiten unserer angestammten OCPs. Die beiden früheren Vorfahren sind von FRP nicht betroffen, wohingegen sich AncOCP1 nur in Gegenwart von FRP (in Molverhältnissen von fünf OCP zu einem FRP) schnell erholen kann, was die Rückumwandlung von OCPR in OCPO um etwa 97 % beschleunigt (ähnlich wie vorhandenes OCP1) (Abb. 1d – f und erweiterte Daten Abb. 4m – t). Da AncOCP1&2 von FRP nicht beeinflusst wird, entwickelte sich die allosterische Beschleunigung der OCP-Erholung nach dem Genduplikationsereignis, das zu OCP1- und OCP2-Paralogen führte, nur entlang der Verzweigung zu OCP1.

Wir haben die Robustheit unserer Schlussfolgerungen gegenüber statistischen Unsicherheiten in unseren wiederbelebten Sequenzen getestet, indem wir zusätzlich eine weniger wahrscheinliche, aber immer noch statistisch plausible alternative Sequenz pro Vorfahre wiederbelebt haben (Einzelheiten siehe Methoden). Biophysikalische Charakterisierungen dieser alternativen OCP-Vorfahrenproteine ​​bestätigen, dass sich entlang des Zweigs, der zu OCP1 führt, eine langsame Erholung und Beschleunigung durch FRP entwickelte (Extended Data Abb. 5a – l).

Als nächstes fragten wir, wann FRP zum ersten Mal in Cyanobakteriengenomen auftrat, im Verhältnis zur Genduplikation, die FRP-reguliertes OCP1 erzeugte. Um dies zu beantworten, haben wir eine ML-Artenphylogenie von OCP-haltigen Cyanobakterienstämmen abgeleitet, die in unserem OCP-Baum gefunden wurden, und das Vorhandensein von FRP- und OCP-Paralogen darauf abgebildet (Extended Data, Abb. 6). Praktisch alle OCP1-haltigen Genome enthalten auch FRP, was darauf hindeutet, dass FRP zeitnah zu der Duplikation gewonnen wurde, die OCP1 produzierte. Wo genau in der Phylogenie der Art die aufeinanderfolgenden OCP-Duplikationen auftraten, ist schwer zu sagen, da OCP2- und OCPx-Paraloge sehr sporadische Verteilungen aufweisen und die Beziehungen innerhalb jeder OCP-Gruppe nur schlecht geklärt sind. Gloeobakterien, die in der Phylogenie unserer und anderer Arten18,19,20,21 Schwestern aller anderen Cyanobakterien sind, besitzen nur OCPx, wohingegen Gruppen, die sich unmittelbar danach verzweigen, bereits OCP1 und FRP oder OCP2 oder beides haben. Dies deutet darauf hin, dass die Duplikation, die OCP1 und OCP2 hervorbrachte, relativ schnell erfolgte, nachdem Gloeobacter spp. von allen anderen Cyanobakterien abgespalten und dass FRP etwa zur gleichen Zeit in das System rekrutiert wurde.

Unser nächstes Ziel war es, den Ursprung von FRP zu verstehen. Homologe von FRP (als FRP-like, FRPL bezeichnet) können auch in entfernt verwandten Bakterien gefunden werden8,22, hauptsächlich Proteobakterien und Acidobakterien, was auf einen Ursprung weit über Cyanobakterien hinaus schließen lässt. Um diese Theorie zu testen, haben wir intensiv nach FRP-Homologen in und außerhalb von Cyanobakterien gesucht und daraus eine ML-Phylogenie abgeleitet. Unser Baum weist eine stark unterstützte Aufteilung zwischen allen FRPs und allen FRPLs auf (Abb. 2a). Eine kleine Gruppe delta-proteobakterieller FRPLs verzweigt sich am nächsten zur Cyanobakterien-FRP-Gruppe mit hoher statistischer Unterstützung (ungefährer Likelihood-Ratio-Test (aLRT) = 60,9, Transfer-Bootstrap-Erwartungen (TBE) von 0,99). Allerdings springen in einigen Bootstrap-Läufen FRPLs anderer Bakterientaxa mit langen Endzweigen in diese Gruppe, was zu einer schlechten Felsenstein-Bootstrap-Unterstützung führt (FBP = 0,51), aber die delta-proteobakteriellen FRPLs bleiben in allen Läufen Schwestern von FRP. Weitere FRPLs sind sporadisch in den Proteobakterien und Acidobakterien verbreitet und kommen meist in nicht kultivierten Arten vor (und fehlen in Modellorganismen vollständig). Innerhalb verschiedener Gruppen von Proteobakterien wird unser Baum schlecht aufgelöst, wahrscheinlich aufgrund der kurzen Länge der FRP- und FRPL-Proteine.

a, Reduzierte ML-Phylogenie von Cyanobakterien-FRP (Cyan) und homologen FRPL-Proteinen, wobei die in dieser Studie untersuchten Proteine ​​durch einen magentafarbenen Kreis und den Namen ihrer Wirtsspezies gekennzeichnet sind. Fett gedruckte Zahlen zählen Taxa kollabierter Bakteriengruppen. Die kursive Zahl gibt TBE von 100 Replikaten an. Der Baum wurzelte zwischen Proteobakterien und Acidobakterien und weist auf einen HGT zwischen Delta-Proteobakterien und Cyanobakterien hin (rote Linie). Die Verzweigungslängen stellen die durchschnittlichen Substitutionen pro Standort dar. Der vollständige Baum ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. b, Kristallstruktur des FRPL-Homodimers von P. borbori bei 1,8 Å mit angegebenen Kopfdomänen (PDB-ID 8AG8) c, gedrehte Überlagerung mit FRP (PDB-ID 4JDX von Synechocystis sp . PCC 6803, Ref. 25). rmsd, quadratische Mittelwertabweichung.

Wir haben den Baum zwischen Acidobakterien und Proteobakterien innerhalb der FRPL-Gruppe als die sparsamste Wurzelhypothese verwurzelt. Diese Wurzel weist auf einen horizontalen Gentransfer (HGT) von einem angestammten Delta-Proteobakterium in ein angestammtes Cyanobakterium hin und weist außerdem auf viele sporadische Verluste von FRPL in Acidobakterien und Proteobakterien hin (Abb. 2a). Eine Wurzel innerhalb der FRP-Gruppe würde dagegen mehr und weniger plausible HGT-Ereignisse erfordern: zumindest von Cyanobakterien in nur eine kleine Gruppe von Proteobakterien, dann in Acidobakterien und dann von relativ modernen Acidobakterien in frühe Proteobakterien. Eine Wurzel zwischen FRPs und FRPLs würde einen Ursprung des Proteins in der LCA aller Bakterien erfordern23, was auf Verluste in vielen großen Bakteriengruppen sowie auf den gleichen zeitlich unplausiblen Transfer von modernen Acidobakterien in die LCA von Proteobakterien hinweisen würde (siehe ergänzende Diskussion für). Einzelheiten). Infolgedessen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass FRP höchstwahrscheinlich zu Beginn der Cyanobakteriengeschichte horizontal von einem Vorfahren-Cyanobakterium erworben wurde.

Um den angestammten Zustand von FRPL-Proteinen zu verstehen, bevor sie in Cyanobakterien übertragen wurden, haben wir die FRPL heterolog aus einem der wenigen isolierten mesophilen Bakterien exprimiert, gereinigt und charakterisiert, die FRPL (PbFRPL) aufweisen: dem Gamma-Proteobakterium Pseudomonas borbori, einem nahen Verwandten von P. aeruginosa24. Die Zirkulardichroismus-Spektroskopie von PbFRPL zeigte die typische ausschließlich alpha-helikale Faltung, die zuvor in FRP in Lösung gefunden wurde, und die native Massenspektrometrie bestätigte den charakteristischen dimeren Zustand8,14 (Extended Data Abb. 7a–c). Wir haben die Kristallstruktur von PbFRPL mit einer Auflösung von 1,8 Å gelöst (Tabelle 1). Die N-terminale Domäne besteht aus zwei antiparallelen Alpha-Helices mit einer Länge von etwa 50 Å und verfügt über eine Homodimerisierungsschnittstelle ähnlich denen in FRPs mit einer geschätzten vergrabenen Oberfläche von etwa 675 Å2. Die C-terminale Kopfdomäne, von der angenommen wird, dass sie in FRP mit OCP1 interagiert (Ref. 25, 26, 27), ist auch in PbFRPL vorhanden und besteht aus drei ineinandergreifenden Alpha-Helices. Insgesamt wurden PbFRPL und FRP aus Synechocystis sp. PCC 6803 (Protein Data Bank (PDB) ID 4JDX, Ref. 25) überlagert mit einer quadratischen Mittelwertabweichung von 2,08 Å (Abb. 2b, c). Die strukturellen Eigenschaften von PbFRPL sind daher denen von cyanobakteriellem FRP sehr ähnlich.

Es ist unklar, welche Funktion FRPLs erfüllen, aber sie können nicht OCP regulieren, da Genome, die FRPL enthalten, weder OCPs noch Homologe ihrer N-terminalen Domänen- oder CTD-ähnlichen Proteine ​​(HCP bzw. CTDH) enthalten. In P. borbori ist das frpl-Gen auf seinem einzelnen Chromosom kodiert, und wir haben keine OCP-, HCP- oder CTDH-Homologe gefunden (Extended Data Abb. 7d). Epifluoreszenzmikroskopie von PbFRPL, fusioniert mit einem mVenus-Fluorophor und exprimiert von einem Plasmid unter seinem nativen Promotor in P. borbori, zeigte eine homogene Verteilung über die gesamte Zelle während des exponentiellen Wachstums und eine zusätzliche Konzentration an den Zellpolen beim Hungern mit zunehmender Gesamtzelle integrierte Fluoreszenz um etwa das 2,5- bis 3,4-fache über dem Wildtyp-Anstieg (Extended Data Abb. 7e – g). Wenn man bedenkt, dass wir die Anzahl der Proteinkopien hier nicht kontrollieren können, fällt auf, dass sich die Lokalisierung und Menge von PbFRPL als Reaktion auf den Hunger ändert. Unsere Daten deuten darauf hin, dass FRPLs trotz ihrer äußerst ähnlichen Strukturen eine potenziell stressbedingte Funktion ausüben, die in keinem Zusammenhang mit OCPs und der Regulierung des Lichtschutzes stehen muss.

Die gemeinsame Faltung von FRPL und FRP legt nahe, dass FRPLs möglicherweise produktiv mit OCP interagieren können, was bedeutet, dass sie nach der Übertragung in Cyanobakterien möglicherweise keine zusätzlichen Modifikationen benötigten, um sofort in ihrem Lichtschutzsystem zu funktionieren. Um dies zu testen, haben wir mehrere FRPLs aus vorhandenen Arten gereinigt und ihre Wirkung auf die Photowiederherstellung von vorhandenen OCP1 untersucht. Wir haben FRPLs aus vier Organismen ausgewählt, die die Vielfalt der FRPL-haltigen Bakteriengruppen in unserem Stammbaum abdecken: P. borbori, Methylocaldum sp. (ein weiteres Gamma-Proteobakterium), Chlorobi sp. (eine Art der FCB-Gruppe) und ein Delta-Proteobakterium der Familie Desulfobacteraceae, das eine der am nächsten zum HGT-Ereignis in Cyanobakterien auf unserem Baum vorhandenen Sequenzen darstellt (Abb. 2a). FRPL aus P. borbori, Methylocaldum sp. und Chlorobi sp. hatte praktisch keinen Einfluss auf die Fotowiederherstellung von OCP1. Allerdings zeigte die FRPL von Desulfobacteraceae die typische Beschleunigung der Erholung von OCP1 von der Photokonversion um etwa 93 % (bei Inkubation in einem äquimolaren Verhältnis von OCP1 zu FRPL) im Vergleich zu OCP1 allein (Abb. 3a, b und erweiterte Daten Abb. 7h–k). . Dies weist darauf hin, dass die Fähigkeit zur Regulierung von OCP1 bereits zum Zeitpunkt des HGT-Ereignisses bestand, das FRP erstmals in Cyanobakterien übertrug. Um diese Theorie weiter zu testen, haben wir zusätzlich zwei angestammte Proteine ​​wiederbelebt: FRPLpreHGT, das neueste FRPL, das wir vor dem HGT-Ereignis rekonstruieren können, und FRPpostHGT, das die Ökobilanz aller FRP in Cyanobakterien nach dem HGT darstellt (Abb. 3c). Beide angestammten Proteine ​​zeigen auch den typischen beschleunigenden FRP-Effekt auf die Photowiederherstellung von OCP1 und erbringen fast die gleiche Leistung wie vorhandenes FRP (Abb. 3d, e und erweiterte Daten Abb. 8a – d). Diese Schlussfolgerung ist noch robuster gegenüber alternativen angestammten FRP- und angestammten FRPL-Proteinen mit leicht unterschiedlichen Sequenzen, die wir auf der Grundlage einer anfänglichen FRP(L)-Phylogenie zuvor mit insgesamt weniger Sequenzen abgeleitet hatten (Extended Data Abb. 8e – j).

a,b, Erholung durch Photokonversion von vorhandenem OCP1 aus Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) mit vorhandener FRPL von P. borbori (a) oder einer Desulfobacteriaceae (Desulfo.)-Art (b) bei unterschiedlichen Molverhältnissen, wie angegeben bei 20 °C mit jeweiligen mittleren Erholungszeitkonstanten (τ) und SD von drei unabhängigen repliziert. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt. ND, nicht bestimmbar. c, Schematische FRP(L)-Phylogenie mit rekonstruierten Vorfahrenproteinen und getesteten vorhandenen FRPLs. Der vollständige Baum ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. d, e, Erholung nach der Photokonvertierung von vorhandenem SYNY3 OCP1 mit angestammtem FRPL (FRPLpreHGT), das vor (d) existierte, und angestammtem FRP (FRPpostHGT), das nach dem HGT (e) existierte unterschiedliche Molverhältnisse, wie bei 20 °C angegeben, mit den jeweiligen mittleren Erholungszeitkonstanten (τ) und SD von drei unabhängigen Replikaten. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die meisten FRPLs nicht als allosterische Regulatoren von OCP1 fungieren können, dass aber eine kleine Untergruppe von ihnen diese Fähigkeit zufällig erworben hat. Da dies in einem Genom geschah, das kein OCP enthielt, ist diese Fähigkeit völlig zufällig und kann nicht das Ergebnis einer direkten natürlichen Selektion gewesen sein. Im Prinzip hätte dies es dem Protein ermöglicht, in dem völlig unabhängigen Lichtschutzsystem der Cyanobakterien zu funktionieren, sobald es zum ersten Mal in deren Genom übertragen wurde.

Da einige FRPLs bereits auf die Interaktion mit OCP vorbereitet zu sein scheinen, bevor sie in Cyanobakterien gelangten, vermuteten wir, dass die Schnittstelle für ihre Interaktion möglicherweise auch bereits in AncOCPall vorhanden ist, selbst wenn die allosterische Verbindung zur Beschleunigung der Photowiederherstellung noch nicht vollständig entwickelt war. Die analytische Größenausschlusschromatographie (SEC) photoaktivierter roter Formen von AncOCPall (AncOCPallR), die mit vorhandenem FRP inkubiert wurden, zeigte eine erhöhte Größe im Vergleich zu AncOCPallR allein (Abb. 4a), was darauf hinweist, dass FRP bereits an AncOCPallR bindet. Wir fragten, ob wir die allosterische Reaktion durch die Zugabe von FRP im Überschuss zur OCPRtoOCPO-Rückgewinnungsreaktion auslösen könnten, und wiederholten unsere ersten Experimente (Abb. 1d), diesmal jedoch mit einem viel größeren Molverhältnis von FRP im Verhältnis zu OCP. Zu unserer Überraschung erhöhte sich die Erholungszeit statt einer Beschleunigung drastisch von 166 ± 10 auf 288 ± 10 s bzw. 609 ± 5 s, wenn eine äquimolare Menge (von OCP zu FRP) bzw. ein fünffacher molarer Überschuss an FRP verwendet wurde (Abb . 4b). Diese Verlangsamung trat auch in AncOCP1 und 2 auf und wenn eines der angestammten FRPs oder angestammten FRPLs hinzugefügt wurde (Abb. 4c und erweiterte Daten, Abb. 4u – x). Um auszuschließen, dass diese Verlangsamung nur durch sterische Effekte oder molekulare Überfüllung verursacht wird, haben wir die Experimente mit PbFRPL wiederholt (das selbst bei Zugabe im molaren Überschuss praktisch keinen Einfluss auf die Erholungszeit von OCP1 hat: Abb. 3a) und ebenfalls virtuell gefunden Keine Auswirkung auf die Genesung von AncOCPall (Extended Data Abb. 4y).

a, Analytische SEC von AncOCPall und AncOCPall-FRP-Komplexen mit (OCPR) oder ohne Beleuchtung mit konstantem Blaulicht (OCPO) während der Chromatographie. b,c, Erholung aus der Photokonversion von AncOCPall mit unterschiedlichen Molverhältnissen des vorhandenen FRP aus Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) (b) oder FRPpostHGT (c) bei 20 °C mit den jeweiligen mittleren Erholungszeitkonstanten (τ) und SD von drei unabhängigen Replikaten. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt. Die Daten für „kein FRP“ und „5:1 FRP“ in b sind zum Vergleich Abb. 1d entnommen. d, AlphaFold2-Modell der Interaktion zwischen FRP (cyan) und der CTD von SYNY3 OCP1 (grün). e, gedrehter Zoom (des schwarz umrahmten Bereichs in d) in die Bindungsschnittstelle, mit AncOCPall (in Weizen) überlagert auf OCP1. An der Bindung beteiligte Aminosäuren sind markiert. In beiden OCPs konservierte Standorte sind schwarz. Stickstoff in Blau und Sauerstoff in Rot. Die Restnummern folgen SYNY3 OCP1. Die Einfügung zeigt die PP für die angegebenen Aminosäuren in der Bindungsschnittstelle des rekonstruierten AncOCPall-Proteins. f, Native PAGE des angestammten OCPO ohne Beleuchtung (links) und OCPR bei konstanter Blaulichtbeleuchtung (rechts) zeigen ihre oligomeren Zustände. Ein Vergleich mit OCP1 (Ref. 29,58) weist auf konservierte Dimerisierungsschnittstellen hin, die sich zwischen OCPO und OCPR unterscheiden. Als molekulare Marker wurden eine OCP-Mutante (70 kDa) und die CTD von OCP1 (29 kDa) verwendet, die beide beleuchtungsunabhängige Dimere bilden. Die Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Die alleinige Bindung von FRP reicht daher nicht aus, damit der beschleunigende allosterische Effekt auftritt. Stattdessen behindert es die Photowiederherstellung von AncOCPall bei einem hohen molaren Überschuss an FRP. Wiederholte schwache Bindung oder ein FRP, das nicht im richtigen Zeitrahmen dissoziiert, könnte den Wiederherstellungsprozess von AncOCPall unterbrechen oder verzögern. Darüber hinaus müssen strukturelle Merkmale auf der OCP-Seite, wie die flexible Linkerschleife zwischen der N-terminalen Domäne und CTD oder die kurze N-terminale Verlängerung, möglicherweise weiter verfeinert werden, damit die komplexe und hocheffiziente allosterische Reaktion des vorhandenen OCP1 wirksam wird Platz16,26.

Unsere Experimente zeigen, dass die Ökobilanz aller OCPs bereits über eine latente Fähigkeit zur Interaktion mit FRP verfügte, obwohl diese Interaktion noch nicht in der Lage war, die Erholung zu beschleunigen. Dies impliziert, dass zumindest dieses Interaktionspotential zwischen OCP und FRP rein zufällig entstanden ist, noch bevor diese Proteine ​​​​zum ersten Mal in einem angestammten Cyanobakterium aufeinander trafen.

Um die strukturelle Grundlage dieser latenten Affinität zu verstehen, haben wir ein AlphaFold2-Modell (Lit. 28) des OCP1-FRP-Komplexes abgeleitet. Es wurde mit Sicherheit eine Wechselwirkung zwischen der CTD von OCP1 und FRP vorhergesagt (Abb. 4d und erweiterte Daten Abb. 9a, f), die mit früheren Kleinwinkel-Röntgenstreuungsdaten übereinstimmt . Die Interaktion nutzt die gleiche hydrophobe Oberfläche wie OCP1, um in seinem roten Zustand auf dem Phycobilisom zu dimerisieren29. Es wurde die Theorie aufgestellt, dass FRP die Ablösung von OCP1R vom Phycobilisom begünstigt, indem es die Assoziationskonstante der Bindung nach unten verschiebt und die Erholung beschleunigt, indem es mit dieser Dimerschnittstelle in OCP1 konkurriert (Lit. 27). Die Reste und Ladungen, die sich als wichtig für diese Dimerschnittstelle erwiesen haben, sind auch in unseren angestammten OCPs vorhanden (Extended Data Abb. 3a), was möglicherweise erklärt, warum FRP bereits mit AncOCPall interagieren kann. Wir haben diese Hypothese auf zwei Arten getestet: Zuerst haben wir ein AlphaFold2-Modell der CTD von AncOCPall abgeleitet und seine Oberflächen mit der CTD von OCP1 verglichen. AncOCPall besitzt die gleiche hydrophobe Oberfläche wie OCP1, wobei praktisch alle Schnittstellenstellen oder Ladungen zwischen den beiden Proteinen identisch sind. AlphaFold2 sagt zusätzlich eine Wechselwirkung zwischen dieser Oberfläche in AncOCPall und FRP voraus (Abb. 4e und Extended Data Abb. 9b – e, g). Zweitens weist dieses Modell weiter darauf hin, dass die Dimerisierung im roten Zustand ein uraltes Merkmal aller OCPs sein sollte. Um dies zu testen, haben wir Native PAGE verwendet, um zu verstehen, ob die OCPs unserer Vorfahren auch in ihrer aktivierten, roten Form dimerisieren. In Übereinstimmung mit unserer Vorhersage führt die Aktivierung zur Bildung von Komplexen, deren Größe mit den Homodimeren in AncOCPallR und AncOCP1R übereinstimmt. Wir haben in AncOCP1&2 keine roten Dimere nachgewiesen, wahrscheinlich aufgrund der extrem schnellen Erholungszeit, die technisch gesehen die Aufrechterhaltung der roten Form im Gel verhindert (Abb. 4f).

Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass die von FRP genutzte Bindungsoberfläche eine alte Dimerschnittstelle der roten Form von OCP ist, die bereits in der LCA aller OCPs vorhanden war, noch bevor FRP in das Cyanobakteriensystem rekrutiert wurde.

OCPx-Paraloge sind von FRP nicht mehr betroffen16,30. Um die zugrunde liegenden strukturellen Veränderungen zwischen AncOCPall und OCPx zu identifizieren, haben wir die Interaktionsvorhersagen mit der CTD eines vorhandenen OCPx von Gloeobacter kilaueensis JS1 wiederholt. AlphaFold2 hat die Interaktionsschnittstelle zwischen FRP und diesem OCPx nicht vorhergesagt, es sei denn, wir haben ein konserviertes Serin in der potenziellen Schnittstelle zurück in das angestammte Tyrosin von AncOCPall geändert (Extended Data Abb. 9h, i). Dies deutet darauf hin, dass OCP-Proteine ​​in den Strukturzustand hinein und aus diesem heraus drifteten, der die Interaktion mit FRP ermöglicht.

Um die strukturellen Ursachen dafür zu verstehen, warum nur einige FRPLs die Erholung von OCP1 nach der Photokonversion beschleunigen, haben wir abschließend die Sequenzen verschiedener FRPLs verglichen. In unserem AlphaFold2-Modell sind Phenylalanin 76, Lysin 102 und Leucin 106 im FRP von Synechocystis sp. PCC 6803 stehen in Kontakt mit OCP1. Die meisten FRPLs haben nicht alle drei Staaten zusammen, gelegentlich aber auch einen oder zwei dieser Staaten. P. borbori FRPL hat beispielsweise Phenylalanin, verfügt aber über ein Tyrosin an Position 102 und ein Serin an Position 106 (Extended Data Abb. 8a). Andere FRPLs enthalten Lysin, ihnen fehlt jedoch Phenylalanin oder Leucin. Dies zeigt, dass die wichtigen Zustände für die Interaktion mit OCP1 individuell über die FRPL-Phylogenie hinweg kommen und gehen. Alle drei Zustände traten nur gemeinsam in FRPLs entlang der Abstammungslinie zu Delta-Proteobakterien und Cyanobakterien auf. Es ist bemerkenswert, dass die HGT in Cyanobakterien genau in diesem engen Fenster der vollständigen Kompatibilität stattfand.

Hier haben wir die Entwicklung einer allosterischen Wechselwirkung im Photoschutzsystem der Cyanobakterien rekonstruiert. Zusammen mit früheren Arbeiten zur anfänglichen Evolution von OCP13,16 ergibt sich ein bemerkenswertes Beispiel für evolutionäres Tüfteln:31 OCPs entstanden höchstwahrscheinlich durch ein Genfusionsereignis, das lediglich einen flexiblen Linker erforderte, um ein fotoschaltbares Protein zu erzeugen aus zwei nicht schaltbaren Komponenten16. Durch die horizontale Erfassung von FRP wurde dann eine neue Komponente eingeführt, die die Wiederherstellung des Grundzustands in OCP1 ohne weitere Modifikation allosterisch beschleunigen konnte. Die Erstellung des voll funktionsfähigen OCP1-FRP-Systems erforderte dann lediglich Substitutionen im OCP, die eine zunächst unproduktive Interaktion mit dem CTD in eine umwandelten, die zu einer Beschleunigung der Photowiederherstellung führte (Abb. 5). Da wir den Erwerb von FRP im Vergleich zu unseren OCP-Vorfahren nicht genau zeitlich festlegen können, wissen wir nicht, ob diese Substitutionen vor oder nach dem Erwerb von FRP erfolgten. Wenn dies schon früher passiert wäre, wäre die regulatorische Interaktion zwischen OCP1 und FRP in dem Moment, in dem FRP horizontal erworben wurde, vollständig funktionsfähig gewesen. Eine weitere bekannte Funktion von FRP ist die Erleichterung der OCP1-Ablösung vom Phycobilisom durch Verschiebung der OCPR-Phycobilisom-Bindungsgleichgewichtskonstante . Obwohl dieser Aspekt in unserer Studie nicht untersucht wurde, gehen wir davon aus, dass die kompetitive FRP-Bindung an ein angestammtes OCPR-Dimer auch die Ablösung vom Phycobilisom erleichtern oder zumindest die Bindung daran erschweren könnte, wodurch tatsächlich ein potenzieller angestammter Regulationsmodus entsteht, der dies auch getan haben könnte war von dem Moment an funktionsfähig, als FRP erstmals in Cyanobakterien auftrat.

Das erste photoschaltbare OCP, das bei starker Lichtbestrahlung eine Konformationsänderung von einem geschlossenen orangen in einen offenen roten Zustand durchläuft, wurde durch ein Fusionsereignis eines angestammten HCP (AncHCP) und eines angestammten CTD-ähnlichen Homologen (AncCTDH) über eine Linkeraddition gebildet16 . Ein FRP-ähnliches Protein (FRPL) wurde horizontal in das nicht verwandte Cyanobakteriensystem übertragen (HGT), nachdem sich zufällig bereits eine latente Bindungsschnittstelle für angestammte OCPs entwickelt hatte. FRP nutzt nun die konservierte CTD-Dimerisierungsschnittstelle von OCPR, um die Erholung von OCP1 nach der Photokonversion stark zu beschleunigen. Die hier nur zur Veranschaulichung verwendete OCP-Struktur ist die PDB-ID 3MG1 (Ref. 58).

Eine offene Frage ist, warum FRP überhaupt in das Lichtschutzsystem der Cyanobakterien rekrutiert wurde. OCPs, die vor der Rekrutierung von FRP existierten, konnten sich schnell von selbst erholen. Warum dieses Funktionssystem komplizieren? Uns sind zwei postulierte adaptive Vorteile bekannt: Erstens könnte die OCP1-FRP-Wechselwirkung eine differenziertere Kontrolle des Energieverbrauchs bei sich schnell ändernden Lichtregimen in der Cyanobakterienzelle ermöglichen13. OCP-vermittelte Lichtschutzsysteme ohne FRP können nur auf der Ebene von Messenger-RNA-Transkripten reguliert werden, die bei der Rückkehr von stressigen zu normalen Lichtbedingungen nur langsam wirken, wohingegen die Kontrolle durch FRP eine potenziell schnellere posttranslationale Regulierung ermöglicht32. Zweitens bietet es möglicherweise einen besseren Lichtschutz bei starken Lichtverhältnissen: OCP2- und OCPx-Paraloge erholen sich so schnell, dass es ihnen schwerfällt, die rote Form bei Raumtemperatur stabil anzusammeln13. Der stabilere rote Zustand von OCP1 kann dann nützlich sein, wenn große Mengen an aktivem OCPR benötigt werden, diese hohe Stabilität kann jedoch auf Kosten der Unfähigkeit gehen, sich alleine zu erholen. In diesem Szenario hätte die Rekrutierung von FRP die Entwicklung eines letztendlich effizienteren Lichtschutzmechanismus ermöglicht. Die Interaktion könnte jedoch auch ein Beispiel für nicht-adaptive Komplexität sein, die einfach nur schwer zu verlieren war33: Der Erwerb von FRP hat es OCP1 möglicherweise ermöglicht, zu „vergessen“, wie es sich selbst effizient erholen kann. Nach dem Verlust dieser Fähigkeit wäre FRP für die volle OCP1-Funktion unverzichtbar geworden.

Die spezifische Kompatibilität der FRPL der Art Desulfobacteraceae mit cyanobakteriellen OCPs ist völlig zufällig, da sich dieses Protein in einem Genom entwickelt hat, das kein OCP enthält. Dies beweist, dass hochkomplementäre Proteinoberflächen völlig zufällig entstehen können und dass solche zunächst zufälligen Wechselwirkungen in die Biologie von Organismen einfließen können. Unsere Arbeit lässt daher die Möglichkeit aufkommen, dass einige oder sogar viele Protein-Protein-Wechselwirkungen zunächst ohne den Einfluss direkter natürlicher Selektion entstehen. Organismen können tatsächlich mit praktisch vollständig ausgebildeten Interaktionen bombardiert werden, die entstehen, wenn horizontaler Transfer, Veränderungen in der zellulären Lokalisierung oder räumlich-zeitliche Expressionsmuster Proteine ​​mit zufällig kompatiblen Oberflächen zusammenbringen. Aus diesem Pool würde die natürliche Selektion dann diejenigen entfernen, die schädlich sind, diejenigen beseitigen, die nützlich sind, und diejenigen ignorieren, die harmlos sind.

Um den phylogenetischen Baum der cyanobakteriellen OCP-Proteine ​​abzuleiten, verwendeten wir den OCP-Datensatz von Muzzopappa et al.16 und richteten die entsprechenden Aminosäuresequenzen der drei darin beschriebenen OCP-Typen (OCP1, OCP2, OCPx) mit MUSCLE (v .3.8.31)34. Wir haben Sequenzen von entweder cyanobakteriellen CTD-ähnlichen homologen Proteinen (CTDHs) oder cyanobakteriellen HCPs als jeweilige Außengruppe hinzugefügt. Ausrichtungen wurden manuell korrigiert, Stellen, die linienspezifischen Insertionen entsprachen, und duplizierte Sequenzen wurden entfernt. Die vollständigen Ausrichtungen finden Sie in den Zusatzdaten 1. Wir haben RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10)35 im PROTGAMMAAUTO-Modus verwendet, um das am besten geeignete Modell der Aminosäureentwicklung zu identifizieren, nämlich die überarbeitete Jones-Taylor-Thornton-Substitutionsmatrix (JTTDCMut). )36 mit empirischen Basisfrequenzen und Gammaverteilung der Ratenvariation zwischen Standorten. Wir haben PhyML (v.3.1)37 mit SPR-Bewegungen verwendet, um zwei ML-Phylogenien mit entweder CTDH- oder HCP-Sequenzen abzuleiten, und haben die Bäume zwischen diesen Sequenzen und allen OCP-Sequenzen in unseren Bäumen verwurzelt. Die beiden Phylogenien weisen grundsätzlich die gleiche Topologie auf, aber der nicht zugeordnete Grad A verzweigt sich zuerst im HCP-Außengruppenbaum (Erweiterte Daten, Abb. 2). Da Gloeobakterien, bei denen es sich bekanntermaßen um früh verzweigende Cyanobakterien handelt18, 19, 20, 21, nur OCPx, aber keine OCP-Homologen der nicht zugeordneten Grade aufweisen, verwendeten wir für weitere Analysen den CTDH-Außengruppenbaum (Extended Data Abb. 1). Die Robustheit jeder Topologie wurde getestet, indem 100 nichtparametrische Bootstraps ausgeführt und zusätzlich aLRT-Statistiken mit PhyML berechnet wurden. Die angestammten OCP-Sequenzen wurden am internen Knoten im CTDH-Außengruppenbaum rekonstruiert, wie in Abb. 1b und Extended Data Abb. 1 dargestellt, unter Verwendung einer Randrekonstruktion im CodeML-Modul von PAML (v.4.9)38 mit dem JTTDCMut-Substitutionsmodell und 16 Gamma-Kategorien. Ahnensequenzen wurden nach Sparsamkeitsregeln zugeschnitten und enthalten die Zustände mit den höchsten A-Posteriori-Wahrscheinlichkeiten (PP) an allen ausgewählten Standorten. Die durchschnittlichen PP-Werte für alle rekonstruierten Proteine ​​sind in Extended Data Abb. 3b – e aufgeführt. Die „altAll“-Alternativsequenzen für jeden rekonstruierten Vorfahren umfassen den Staat mit dem zweithöchsten PP, wenn dieser Staat einen PP > 0,20 hat, andernfalls den ML-Zustand.

Für den phylogenetischen FRP(L)-Baum (Abb. 2a) haben wir am 23. Februar 2022 mithilfe von Online-BLASTP39 Aminosäuresequenzen und die FRP-Aminosäuresequenz von Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) als Abfrage. Um FRPL-Sequenzen gezielt zu finden, haben wir Cyanobakterien (taxid:1117) ausgeschlossen und die Suche gegen SYNY3 FRP und anschließend gegen P. borbori FRPL wiederholt oder explizit in anderen taxonomischen Gruppen als Cyanobakterien gesucht. Zusätzlich haben wir metagenomische Sequenzen aus dem Global Microbial Gene Catalog (GMGC, v.1.0)40 hinzugefügt. Die Sequenzen wurden mit MUSCLE (v.3.8.31) abgeglichen. Das Alignment wurde manuell korrigiert, Stellen, die linienspezifischen Insertionen entsprachen, und duplizierte Sequenzen wurden entfernt. Die vollständige Ausrichtung finden Sie in den Zusatzdaten 1. Wir haben RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) im PROTGAMMAAUTO-Modus unter Verwendung des Akaike-Informationskriteriums verwendet, um das am besten geeignete Modell der Aminosäureentwicklung zu identifizieren, nämlich die Le-Gascuel-Substitutionsmatrix41 mit festen Basisfrequenzen und Gammaverteilung der Ratenvariation zwischen den Standorten. Wir haben die ML-Phylogenie abgeleitet und die Robustheit der Topologie getestet, indem wir 100 nichtparametrische Bootstraps ausgeführt haben. TBEs wurden mit dem BOOSTER-Webtool42 berechnet. Darüber hinaus wurden aLRT-Statistiken mit PhyML (v.3.1) berechnet. Der Baum wurzelte zwischen Acidobakterien und Proteobakterien in der FRPL-Gruppe und deutet auf eine HGT von einem angestammten Delta-Proteobakterium zu einem angestammten Cyanobakterium hin. Der vollständige Baum ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Ancestral FRPL- und Ahnen-FRP-Sequenzen (FRPLpreHGT bzw. FRPpostHGT) wurden an den internen Knoten des Baums mithilfe einer Randrekonstruktion im CodeML-Modul von PAML (v.4.9) mit dem Le- rekonstruiert. Gascuel-Substitutionsmatrix-Modell (LG) und 16 Gamma-Kategorien. Lücken wurden sparsam zugewiesen. Für die Vorfahren, die wir wiederbelebt haben, haben wir den Aminosäurezustand mit dem höchsten PP an jeder Stelle ausgewählt. Die durchschnittlichen PP für die rekonstruierten Proteine ​​sind in Extended Data Abb. 8b, c aufgeführt.

Für den Genbaum-Artenbaum-Abgleich haben wir alle Sequenzen in unserem FRP(L)-Baum identifiziert, die mit Sicherheit einem bestimmten Bakterienstamm zugeordnet werden konnten, der mit seinem Satz von 120 Einzelkopien auch in der Genome Taxonomy Database (GTDB)43 hinterlegt ist Markerproteinsequenzen mithilfe von BLASTP39. Mit diesen ausgerichteten, verketteten Aminosäuresequenzen haben wir mithilfe von IQ-Tree 2 (v.2.2)44 (-m LG, -b 100, -alrt 1.000) einen phylogenetischen ML-Baum abgeleitet und wie oben beschrieben mit Acidobakterien bewurzelt. Wir haben dementsprechend einen Genbaum mit FRP- und FRPL-Sequenzen der entsprechenden Arten abgeleitet und 100 nichtparametrische Bootstraps für diese Teilmenge ausgeführt. Der Abgleich wurde unter Verwendung der ML-Schätzung mit ALEml_undated in ALE45 und der Phylogenie der Wurzelarten sowie den FRP(L)-Bootstrap-Bäumen als Eingabe durchgeführt. Abgeglichene Bäume und ALE-Ausgaben werden in den Quelldaten hinterlegt.

Um die alternativen angestammten FRPL- und alternativen angestammten FRP-Sequenzen (altFRPLpreHGT bzw. altFRPpostHGT) zu rekonstruieren, verwendeten wir ein anfängliches Alignment mit insgesamt weniger Sequenzen. Die vollständige Ausrichtung befindet sich in den Zusatzdaten 1. Ein phylogenetischer ML-Baum mit 100 nichtparametrischen Bootstraps wurde abgeleitet, und die alternativen angestammten FRPL- und alternativen angestammten FRP-Sequenzen wurden entsprechend am internen Knoten dieses Baums rekonstruiert, wie in Abb. 8e der erweiterten Daten dargestellt und ergänzende Abbildung 2 unter Verwendung der Randrekonstruktion im CodeML-Modul von PAML (v.4.9) mit dem Le-Gascuel-Substitutionsmatrix-Substitutionsmodell und 16 Gammakategorien. FSME wurden mit dem BOOSTER-Webtool berechnet. Alternative Abstammungssequenzen wurden nach Sparsamkeitsregeln zugeschnitten und enthalten die Staaten mit dem höchsten PP auf allen ausgewählten Seiten. Die durchschnittlichen PP für die rekonstruierten Proteine ​​sind in Extended Data Abb. 8f, g aufgeführt.

Für den phylogenetischen Artenbaum OCP-haltiger Cyanobakterien haben wir alle Sequenzen in unserem OCP-Baum identifiziert, die mit Sicherheit einem bestimmten Cyanobakterienstamm zugeordnet werden konnten, der mit seinem Satz von 120 Einzelkopie-Markerproteinsequenzen auch bei der GTDB hinterlegt ist. Als Außengruppe haben wir Sequenzsätze eng verwandter Malainabakterien sowie Sätze entfernter verwandter Chloroflexota-Arten hinzugefügt. Wir haben diese verketteten Aminosäuresequenzen verwendet, sie ausgerichtet und mithilfe von RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) im PROTGAMMAAUTO-Modus einen phylogenetischen Baum abgeleitet. Dabei haben wir das Akaike-Informationskriterium verwendet, um das am besten geeignete Modell der Aminosäureentwicklung zu identifizieren war die Le-Gascuel-Substitutionsmatrix41 mit empirischen Basishäufigkeiten und Gammaverteilung der Ratenvariation zwischen Standorten. Wir haben die ML-Phylogenie abgeleitet und die Robustheit der Topologie getestet, indem wir 100 nichtparametrische Bootstraps ausgeführt haben. Wir haben den Baum zwischen Cyanobakterien und der Außengruppe verwurzelt und das Auftreten von frp- und ocp-Genen in entsprechenden Genomen auf der Grundlage von BLASTP- und tBLASTn39-Treffern neben dem Baum kartiert (Extended Data, Abb. 6). Die Zuordnung bestimmter OCP-Sequenzen zu einer OCP-Paraloggruppe basiert auf der Position ihrer übersetzten Aminosäuresequenzen in unserem OCP-Baum (Extended Data, Abb. 1).

DNA-Sequenzen von angestammten OCPs, vorhandenem OCP1 von Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) und FRP (SYNY3) wurden für die Expression in E. coli codonoptimiert und entweder von Genscript Biotech oder Life Technologies (GeneArt) synthetisiert. Die synthetisierten Konstrukte wurden von BamHI- und NotI-Schnittstellen zur Klonierung in einen modifizierten pRSFDuet-1-Vektor (Merck Millipore) flankiert, der eine spezifische 3C-Protease-Spaltstelle des humanen Rhinovirus (HRV) (LEVLFQ/GP) und einen 6xHis-Tag am N kodiert Terminus (resultierendes Plasmid mit der Bezeichnung pRSFDuetM). Nach der Spaltung begannen alle Konstrukte mit GPDPATM. Zur Expression von vorhandenem FRP (SYNY3-Gen slr1964) wurde der pRSFDuetM-FRP-Vektor in E. coli BL21 (DE3) (New England Biolabs) transformiert, die über Nacht bei 37 °C in Luria-Bertani (LB)-Medium gezüchtet wurden (1). % Trypton, 1 % NaCl, 0,5 % Hefeextrakt, pH 7,0), ergänzt mit Kanamycin (Kan, 50 µg ml−1). Am folgenden Tag wurde 1 l LB + Kan mit 10 ml Übernachtkultur beimpft und bei 37 °C inkubiert, bis eine optische Dichte (OD600 nm) von 0,6–0,8 erreicht wurde, dann durch 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid induziert ( IPTG) und in einem Schüttelinkubator für 24 Stunden bei 30 °C gezüchtet. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 10.000 g gesammelt und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Zur Expression von OCPs (vorhandenes OCP1, SYNY3-Gen slr1963 und angestammte OCPs) wurden die entsprechenden pRSFDuetM-OCPxx-Konstrukte in Echinenon-produzierende E. coli BL21 (DE3) transformiert, die ein p25crtO-Plasmid enthalten. Die Expression erfolgte in 1 l LB, ergänzt mit Chloramphenicol (34 µg ml−1) und Kan (50 µg ml−1), das mit 10 ml Übernachtkultur beimpft und in einem Schüttelinkubator bei 37 °C gezüchtet wurde C bis OD600nm = 0,6–0,8. Nach der Induktion mit 0,5 mM IPTG wurden die Zellen 72 Stunden lang bei 25 °C inkubiert und schließlich 10 Minuten lang bei 10.000 g gesammelt und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Zur Reinigung wurden gefrorene Zellpellets in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 12 mM Phosphat, pH 7,4) resuspendiert, ergänzt mit 100 mg Lysozym (Ovobest) und Proteaseinhibitor (1 mM Benzamidin, 1 mM ε-Aminocapronsäure). Die Zelllyse wurde unter Verwendung einer FrenchPress (G. Heinemann) in drei Zyklen bei 18.000 psi durchgeführt. Anschließend wurden die Zelltrümmer 15 Minuten lang bei 4 °C mit 18.000 g pelletiert. Der Überstand wurde mit einer peristaltischen Pumpe auf eine 5 ml Co2+-HiTrap Talon-Rohölsäule (Cytiva) geladen. Die Elution erfolgte mit imidazolhaltigem Puffer (1× PBS + 350 mM Imidazol, pH 7,4), ergänzt mit HRV 3C-Protease in einem Gesamtmassenverhältnis von 500:1 (Protein zu Protease) und dialysiert bei 4 °C in 3C-Protease Puffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM Dithiothreitol, pH 8,5) für 18 Stunden. Die Proteinlösung wurde erneut auf eine Co2+-HiTrap Talon-Rohölsäule geladen, während dieses Mal der Durchfluss gesammelt wurde. Im Fall von FRP wurde die Reinigung durch SEC zum Polieren durchgeführt, während die OCP-Reinigung mit hydrophober Interaktionschromatographie (HIC) zur Entfernung von Apoprotein fortgesetzt wurde. Gesammelte OCP-Durchflüsse wurden über Nacht in HIC-Puffer (500 mM (NH4)2SO4, 100 mM Harnstoff, 5 mM Phosphat, pH 7,5) bei 4 °C dialysiert. Die HIC wurde auf einer HiPrepTM 16/10 Phenyl HP-Säule (Cytiva) in einem automatisierten Azura FPLC-System (Knauer) durchgeführt. Proteine ​​wurden mit einem hydrophilen Puffer (100 mM Harnstoff, 5 mM Phosphat, pH 7,5) eluiert. Carotinoidreiche Proteinfraktionen wurden unter Verwendung von Zentrifugalfiltereinheiten (Pall Corporation) mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10 kDa (MWCO) für die SEC konzentriert. FRP wurde mit 3 kDa MWCO-Zentrifugalfiltereinheiten konzentriert. Anschließend wurden 500 µl jeder konzentrierten Proteinlösung auf eine SuperdexTM 200-Erhöhungssäule 10/300 (Cytiva) geladen und mit 1× PBS eluiert. Die Proteine ​​wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Codon-optimierte Sequenzen, die für vorhandenes FRPL, angestammtes FRP und angestammte FRPL-Proteine ​​kodieren, wurden von Integrated DNA Technologies (IDT) oder Twist Biosciences erhalten. Sie wurden unter Verwendung von Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) in pET-LIC-Vektoren kloniert, die einen N- oder C-terminalen 6xHis-Tag enthielten. Die verwendeten Oligonukleotide sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die korrekte Zusammenstellung wurde durch Sanger Sequencing (Microsynth) überprüft. Plasmide wurden in E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) transformiert. Zur Proteinüberproduktion wurden 50 ml LB, ergänzt mit Carbenicillin (Carb) (100 μg ml−1), mit einer einzelnen Kolonie aus einer frischen LB + Carb-Platte beimpft und über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator gezüchtet. Sechs Chargen von 500 ml LB + Carb wurden mit Nachtkulturen bei OD600nm = 0,01 beimpft und etwa 2,5 Stunden lang auf OD600nm = 0,6–0,8 gezüchtet. Die Proteinüberproduktion wurde mit 1 mM IPTG induziert. Nach 4 Stunden wurden die Zellen bei 4.392 g für 20 Minuten bei 4 °C gesammelt und die Zellpellets wurden bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Zur Reinigung wurden die Zellen in 35 ml Puffer A (300 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol, pH 8,0) resuspendiert und mit einer Tablette cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (Roche) versetzt. Die Zellen wurden zweimal in einem LM10-Mikrofluidizer (Microfluidics) bei 13.000 psi aufgeschlossen. Das Lysat wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 29.930 g gereinigt und durch einen 0,45-µm-Spritzenfilter geleitet und dann auf eine 5 ml Bio-Scale Mini Nuvia Ni-geladene IMAC-Kartusche (BioRad) geladen. Nach dem Waschen mit 25 ml Puffer A wurde das Protein mit einem linearen Gradienten über 20 ml von 0 bis 100 % Puffer B (300 mM NaCl, 20 mM Tris, 500 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol, pH 8,0) eluiert ein NGC-System (BioRad). Fraktionen, die das Protein enthielten, wurden auf hausintern gegossenen 15 % SDS-Gelen verifiziert und für SEC mit einer HiLoad 26/600 Superdex-Säule (Cytiva) in SEC-Puffer (200 mM NaCl, 20 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,5) gepoolt ) in einem NGC-System. Die Reinheit der das Protein enthaltenden Fraktionen wurde auf hausintern gegossenen 15 % SDS-Gelen überprüft und zur Konzentration bei 2.000 g mit Amicon Ultra-Zentrifugalfiltereinheiten (Millipore) mit einem MWCO von 3 kDa gepoolt. Die Proteine ​​wurden bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Um den Carotinoidgehalt von OCP-Holoproteinen zu analysieren, wurden 50 µl konzentrierte Proteinlösung mit 1 ml Aceton gemischt und bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C zentrifugiert, um ausgefälltes Protein abzuzentrifugieren. Der gelbliche Überstand wurde in einem Zentrifugalvakuumkonzentrator (Eppendorf) bei 30 °C eingedampft, bis das Aceton vollständig verdampft war und die Carotinoide als rote Kristalle ausgefallen waren. Die verbleibende Wasserlösung wurde entfernt und die roten Carotinoidkristalle wurden in 50 µl Aceton erneut aufgelöst. Die carotinoidreiche Lösung wurde in ein Probenfläschchen überführt, das in ein UFLC NexeraX2-System (Shimadzu) gestellt wurde, das mit einer Accucore C30-Säule (Thermo Fisher Scientific, 250 × 2,1 mm, 2,6 µm Partikelgröße, 150 Å Porengröße) ausgestattet war. Als Eluenten der mobilen Phase wurden Puffer A (Methanol zu Wasser, 95:5) und Puffer B (Methanol zu THF, 7:3) mit dem folgenden Protokoll verwendet: 0–4,3 Min. 0 % Puffer B, 4,3–8,6 Min. linear Gradient von 0 bis 100 % Puffer B, 8,6–15,6 min 100 % Puffer B, 15,6–20,1 min 0 % Puffer B mit einer konstanten Flussrate von 0,4 ml min−1. Eluierte Carotinoide wurden durch Massenspektrometrie verifiziert, um die Elutionszeiten mit bestimmten Carotinoidspezies zu korrelieren, sowie durch Dünnschichtchromatographie und Vergleich mit Referenzproben.

Absorptionsspektren wurden mit einem Maya2000Pro-Spektrometer (Ocean Optics) aufgezeichnet, das über eine Faser an eine Deuterium-Wolfram-Lichtquelle (Sarspec) und einen Küvettenhalter (CVH100, Thorlabs) gekoppelt war. Für kinetische OCP/FRP-Analysen wurde ein temperaturgesteuerter Küvettenhalter mit einem konstanten Rührgerät qpod2e (Quantum Northwest) fasergekoppelt an ein CCS100/M-Spektrometer (Thorlabs) und eine SLS201L/M-Wolframlichtquelle (Thorlabs). Zur Beleuchtung mit aktinischem Licht wurde eine 3 W Leuchtdiode (Avonec) mit einem Emissionsmaximum bei 455 nm verwendet. Verschiedene OCPO (gemischt mit verschiedenen vorhandenen oder angestammten FRP oder vorhandenen oder angestammten FRPL in verschiedenen Molverhältnissen oder allein) wurden durch Anwenden von blauem Licht für mindestens 3 Minuten und 30 Sekunden oder bis zu einem Plateau in den roten Zustand (OCPR) photogeschaltet erreicht wurde, und die Photowiederherstellung wurde nach dem Abschalten der blauen Lichtquelle konstant bei 550 nm verfolgt. Die Erholungszeitkonstanten (τ) wurden durch Anpassen der Relaxationskurven der OCPR-zu-OCPO-Rückumwandlungen mit einer monoexponentiellen Zerfallsfunktion bestimmt und Standardabweichungen (sd) von drei unabhängigen Replikaten berechnet.

Zur Beurteilung der Sekundärstruktur heterolog hergestellter P. borbori-FRPL (PbFRPL) in Lösung wurde Fernultraviolett-Zirkulardichroismus-Spektroskopie eingesetzt. Das Protein wurde in Zirkulardichroismus-Puffer (100 mM NaF, 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,5) auf eine Konzentration von etwa 50 µg ml−1 verdünnt und in einer 0,1-cm-Küvette bei Raumtemperatur mit einem JASCO J-810 gemessen Spektropolarimeter (Jacso) im Bereich von 190–240 nm in 0,2 nm Scanschritten. Drei aufeinanderfolgende Spektren wurden aufgezeichnet, grundlinienkorrigiert und gemittelt.

Die FRPL-Proteinprobe von P. borbori (PbFRPL) wurde bei –20 °C gelagert, bevor sie durch mehrere Konzentrierungs- und Verdünnungsrunden unter Verwendung von Pierce-Proteinkonzentratoren (Thermo Fisher) in 200 mM Ammoniumacetat (pH 6,8) gepuffert wurde. Die Probe wurde dann unmittelbar vor den Messungen auf 4 µM (Monomer) verdünnt. Die Daten wurden mit hauseigenen vergoldeten Kapillaren auf einem Q Exactive-Massenspektrometer (ThermoFisher Scientific) gesammelt, das im Positivionenmodus mit einer Quellentemperatur von 100 °C und einer Kapillarspannung von 1,2 kV betrieben wurde. Das Einfangen in der Quelle wurde auf –100 V eingestellt, um die Dissoziation kleiner Ionenaddukte zu unterstützen. Die Ionentransferoptik und die Spannungsgradienten in den Instrumenten wurden für eine ideale Übertragung optimiert. Spektren wurden mit zehn Mikroscans erfasst, um das Signal-Rausch-Verhältnis mit Übergangszeiten von 64 ms zu erhöhen, was einer Auflösung von 17.500 bei m/z = 200 und einem AGC-Ziel von 1,0 × 106 entspricht. Der Rauschschwellenparameter war auf drei eingestellt und der verwendete Scanbereich betrug 350 bis 8.000 m/z.

Die Kristallisation von P. borbori FRPL (PbFRPL) wurde nach der Methode des hängenden Tropfens bei 20 °C in 2-µl-Tropfen durchgeführt, die aus gleichen Mengen an Protein- und Fällungslösungen bestanden. PbFRPL kristallisierte bei 119 µM innerhalb von 20 Tagen in 0,2 M Li2SO4, 0,1 M CHES, pH 9,5 und 1,4 M Natrium:Kaliumtartrat. Vor der Datenerfassung wurden die Kristalle in flüssigem Stickstoff ohne Verwendung von Kryoschutzmitteln schockgefroren. Synchrotrondaten wurden unter kryogenen Bedingungen an der Strahllinie P13 gesammelt, die vom Europäischen Labor für Molekularbiologie (EMBL) Hamburg am Speicherring PETRA III (Deutsches Elektronensynchrotron) betrieben wird46. Die Daten wurden mit XDS integriert und skaliert und mit XSCALE47 zusammengeführt. Strukturen wurden durch molekularen Ersatz mit PHASER48 bestimmt, manuell in COOT49 erstellt und mit PHENIX50 verfeinert. Zur Strukturbestimmung durch molekularen Ersatz wurde die Kristallstruktur von FRP aus Synechocystis sp. Als Suchmodell wurde PCC 6803 (PDB ID 4JDX, Ref. 25) verwendet. Die endgültige Struktur von PbFRPL wurde unter der Zugangsnummer 8AG8 in die RCSB PDB hochgeladen. Die Daten wurden mit PyMol (v.2.4.0)51 gerendert und visualisiert.

Nach mehreren Kultivierungsrunden haben wir das gesamte Genom von P. borbori neu sequenziert, um einen Verlust des frpl-Gens bei der Kultivierung (eine mögliche Erklärung für das Fehlen von FRPL in allen Modellorganismen), eine Plasmidlokalisierung (die HGT erleichtern könnte) oder eine Probenkontamination auszuschließen , stellte jedoch fest, dass das Genom ein einzelnes, kreisförmiges Chromosom mit einer Größe von 5,34 MB ist, das eine Kopie des frpl-Gens, aber keine OCP-, HCP- oder CTDH-Homologen enthält (Extended Data Abb. 7d). Genomische DNA von P. borbori in der stationären Phase wurde mit dem NucleoBond HMW DNA Kit (Macherey-Nagel) gemäß den Richtlinien des Herstellers und unter Verwendung von Lysozym zur Zelllyse (Endkonzentration 1 mg ml−1) für 1 Stunde bei 37 °C erhalten 2 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Die DNA-Qualität und -Konzentration wurde mit dem NanoDrop 8000-Spektrophotometer und dem Qubit 3-Fluorometer unter Verwendung doppelsträngiger DNA-BR-Reagenzien bewertet. Die Bibliotheksvorbereitung wurde unter Verwendung des Ligation Sequencing Kit SQK-LSK109 (Oxford Nanopore Technologies) gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die eingegebene DNA verfünffacht wurde, um der im Protokoll erwarteten Molarität zu entsprechen, da keine DNA-Scherung angewendet wurde. Die Sequenzierung wurde 24 Stunden lang auf einem MinION Mk1B-Gerät unter Verwendung einer „Flongle Flow Cell“ (FLO-FLG001, Zellchemie R9.4.1) durchgeführt. Nanoporendaten wurden mit der Base-Calling-Software ONT Guppy Base-Calling durchgeführt. Lange Lesevorgänge wurden mit canu52 zusammengestellt, was zu einem einzelnen kreisförmigen Chromosom führte. Rohdaten werden im Sequence Read Archive des National Center for Biotechnology Information (NCBI) hinterlegt und können unter der BioProject-Nr. abgerufen werden. PRJNA865569 und BioSample-Zugangsnr. SAMN30120905.

Die Typfärbung DSM17834 des Delta-Proteobakteriums P. borbori wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) erworben. Es wurde aerob in PME-Medium (0,5 % Pepton, 0,3 % Fleischextrakt, pH 7,0) bei 28 °C kultiviert und eine Wachstumskurve biologischer Dreifachversuche aufgezeichnet. Die Generationszeit (G) während des exponentiellen Wachstums wurde mit der Formel \(G = \frac{{{{\Delta }}t}}{{3.3\log \left( {\frac{{{\mathrm{OD}} }_2}}{{{\mathrm{OD}}_1}}} \right)}}\).

Proteinfusionen für die In-vivo-Lokalisierung mit Epi-Fluoreszenzmikroskopie wurden durch PCR-Amplifikation des frpl-Gens von P. borbori einschließlich 200 bp der 5′-untranslatierten Region und Insertion in pSG1164-Vektoren mit einer N- oder C-terminalen mVenus-Kodierungssequenz erzeugt eine „GGGGGSL“-Linkersequenz im Rahmen unter Verwendung von Gibson Assembly Master Mix (NEB). Der korrekte Zusammenbau wurde durch Sanger Sequencing (Microsynth) überprüft. Chemisch kompetente P. borbori wurden durch Modifikation eines Protokolls von Irani und John53, das ursprünglich für P. aeruginosa entwickelt wurde, wie folgt hergestellt: Das Medium wurde auf PME geändert und die Temperaturen wurden auf 28 °C gesenkt. Plasmide wurden nach dem Transformationsprotokoll von Irani und John53 in P. borbori transformiert, wobei jedoch die Hitzeschocktemperatur auf 30 °C, das Medium auf PME, die Wachstumstemperatur auf 28 °C und die Carbenicillinkonzentration auf 100 µg ml−1 geändert wurden. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert, bis Kolonien sichtbar waren.

Für die Epifluoreszenzmikroskopie wurden P. borbori-Zellen bei 28 °C und 200 U/min auf eine OD600 = 0,6 für „exponentielles Wachstum“ und für 2 Tage auf eine OD600 von etwa 1,0 für „Hunger“-Bedingungen in PME-Medien gezüchtet. Die Zellen wurden auf 1 % Agarose-Pads fixiert, indem 100 µl geschmolzene Agarose zwischen zwei Deckgläser (12 mm, Menzel) gelegt wurden. Anschließend wurden 3 µl der Kultur auf ein rundes Deckglas (25 mm; Marienfeld) gegeben und mit einem Agarose-Pad fixiert. Für die Weitfeldbildaufnahme wurde ein Zeiss Observer A1-Mikroskop (Carl Zeiss) mit einem Ölimmersionsobjektiv (100-fache Vergrößerung, 1,45 numerische Apertur, Alpha Plan-FLUAR; Carl Zeiss) mit einer ladungsgekoppelten Kamera (CoolSNAP EZ; Photometrie) und einer HXP 120 Metallhalogenid-Fluoreszenzbeleuchtung mit Intensitätsregelung. Für die Epifluoreszenzmikroskopie wurde ein grün fluoreszierendes Proteinfilterset verwendet (BrightLine 470/40, Beamsplitter 495 und Brightline 525/50). Die Proben wurden 0,5 bis 2 s lang in der Zellmitte beleuchtet. Die integrierte Ganzzellfluoreszenz wurde pro Zelle bestimmt und um die Hintergrundfluoreszenz korrigiert. Die endgültige Bearbeitung der Bilder erfolgte in ImageJ2/FIJI (v.1.52)54,55.

Die analytische SEC wurde mit einer Superdex 75 Boost 3,2/300-Säule (Cytiva) durchgeführt, die mit 1× PBS bei einer Flussrate von 0,1 ml min−1 und einem Gesamtprobeninjektionsvolumen von 20 µl äquilibriert war. Zur Messung bei Blaulichtbeleuchtung wurden vier 3-W-LEDs (Avonec) mit einem Emissionsmaximum bei 455 nm auf einem 20-cm-Kühlkörper in konstanten Abständen vor der SEC-Säule montiert, um die Probe auf der Säule kontinuierlich zu beleuchten. Die Absorption wurde bei 280, 496 und 550 nm aufgezeichnet, um Elutionsprofile zu verfolgen.

AlphaFold2-Proteinkomplexmodelle wurden am 20. Mai 2022 mit dem ColabFold-Server56 generiert, wobei als Eingabesequenzen die CTD von OCP1 aus Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) oder AncOCPall und FRP (SYNY3) mit Standardeinstellungen. Darüber hinaus wurde die Struktur von AncOCPall in voller Länge separat vorhergesagt. Am 3. November 2022 wiederholten wir die Analyse mit der CTD von OCPx aus G. kilaueensis JS1 oder einer S264Y-Mutante (Serin an Position 264 (SYNY3-Nummerierung) wurde in Tyrosin geändert) dieses OCPx mit FRP (SYNY3). Modellierte Strukturen werden in den Quelldaten hinterlegt. Die Daten wurden mit PyMol (v.2.4.0)51 gerendert und visualisiert.

Native PAGE wurde in einer Mini-Protean-Tetra-Zelle (Biorad) unter Verwendung hauseigener gegossener Gradientengele mit einer Acrylamidkonzentration von 3–14 % in einem Tris-Glycin-Puffersystem ohne SDS durchgeführt, um native Proteinbedingungen zu erhalten. Es wurde kein Stapelgel verwendet. Die Elektrophoresekammer wurde ständig in einem Kühlschrank gekühlt und von vier 3-W-LEDs (Avonec) mit einem Emissionsmaximum bei 455 nm beleuchtet, um die OCP-Proteine ​​im Gel fotoaktiv zu schalten. Die Spannung wurde für 240 min konstant auf 80 V und anschließend für weitere 100 min auf 120 V eingestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten sind im Open Research Data Repository der Max-Planck-Gesellschaft (Edmond) unter https://doi.org/10.17617/3.44RHFZ verfügbar. Kristallographiedaten sind im RCSB PDB unter der Zugangsnummer 8AG8 verfügbar. Sequenzierungsdaten sind im NCBI Sequence Read Archive unter BioProject PRJNA865569 verfügbar.

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NS, SGG und GKAH werden von der Max-Planck-Gesellschaft gefördert. AARR und D.Schindler werden von der Max-Planck-Gesellschaft im Rahmen des MaxGENESYS-Projekts gefördert. TF dankt der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Finanzierung der Azura FPLC-Maschine (Förderungsnummern FR 1276/5-1 und FR 1276/6-1) und der Einstein-Stiftung. Mitfinanziert durch die Europäische Union (ERC, EVOCATION, 101040472). Die geäußerten Ansichten und Meinungen sind jedoch ausschließlich die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die der Europäischen Union oder des Europäischen Forschungsrats wider. Weder die Europäische Union noch die Bewilligungsbehörde können hierfür haftbar gemacht werden. PLG dankt der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Unterstützung (Fördernummer GR1670/27-1). JLPB und D.Saman. Wir danken dem Leverhulme Trust (Zuschuss-Nr. RPG-2021-246) für die Unterstützung. Zum Zwecke des Open Access hat JLPB eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf die vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. Wir danken NN Tavraz (TU Berlin) und C.-N. Mais (Universität Marburg) für Laborunterstützung.

Open-Access-Förderung durch die Max-Planck-Gesellschaft.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Niklas Steube, Marcus Moldenhauer.

Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg, Deutschland

Niklas Steube, Adán A. Ramírez Rojas, Sriram G. Garg, Daniel Schindler & Georg KA Hochberg

Institute of Chemistry PC14, Technische Universität Berlin, Berlin, Germany

Marcus Moldenhauer & Thomas Friedrich

Fachbereich Chemie, Universität Marburg, Marburg, Deutschland

Paul Weiland, Alexandra Kilb, Peter L. Graumann, Gert Bange & Georg KA Hochberg

Zentrum für Synthetische Mikrobiologie (SYNMIKRO), Marburg, Deutschland

Paul Weiland, Alexandra Kilb, Daniel Schindler, Peter L. Graumann, Gert Bange & Georg K. A. Hochberg

Fachbereich Chemie, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Dominic Saman & Justin LP Benesch

Kavli Institute for Nanoscience Discovery, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Dominic Saman & Justin LP Benesch

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NS, MM, TF und GKAH konzipierten das Projekt und überwachten die Erstellung des Manuskripts. NS führte Phylogenetik, Rekonstruktion der Ahnensequenz, Proteinreinigung, Zirkulardichroismus-Spektroskopie und genetische Manipulation von P. borbori durch. MM führte Proteinreinigung sowie biophysikalische und biochemische Experimente durch. PW und GB führten eine Proteinkristallographie durch und interpretierten die Daten. AK und PLG führten Epifluoreszenzmikroskopie durch und interpretierten die Daten. D.Saman und JLPB führten native Massenspektrometrie durch und interpretierten die Daten. AARR und D. Schindler sequenzierten P. borbori und analysierten die Daten. SGG leitete die phylogenetischen Artenbäume ab und führte den Genbaum-Artenbaum-Abgleich durch. NS, MM, TF und GKAH interpretierten alle Daten. Alle Autoren trugen zum Schreiben und zur Diskussion des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Thomas Friedrich oder Georg KA Hochberg.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Ecology & Evolution dankt Per Jemth und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

ML-Phylogenie von OCP-Proteinen mit rekonstruierten Vorfahrenproteinen (Anc) an markierten Knoten und cyanobakteriellen C-terminalen domänenähnlichen Proteinen (CTDH) als Außengruppe (Einfügung mit schwarzen Umrissen). OCP-Paralogs und Vorfahren sind wie in Abb. 1b farblich gekennzeichnet. Wir haben zusätzlich eine konservativere Sequenz für den letzten gemeinsamen Vorfahren von OCP1 (conAncOCP1, in Grau) (Extended Data Abb. 3a+e, 4d,h,l,p,t) sowie alternative „altAll“-Vorfahren für jeden Knoten getestet auf diesem Baum (Extended Data Abb. 3a, 5a-l). Kursive Zahlen sind Felsenstein-Bootstrap-Wahrscheinlichkeiten (FBP) von 100 Replikaten. Graue Zahlen sind ungefähre Likelihood-Ratio-Testwerte (aLRT). Die Verzweigungslängen stellen die durchschnittlichen Substitutionen pro Standort dar. Mit grauen Umrissen einfügen ist eine dreifache Vergrößerung, um die Zweigtopologie in diesem Bereich richtig anzuzeigen. zugrunde liegendes Mehrfachsequenz-Alignment in Supplementary Data 1.

ML-Phylogenie von OCP-Proteinen wie in Extended Data Abb. 1, jedoch mit cyanobakteriellen helikalen Carotinoidproteinen (HCP, Insert) als Außengruppe. zugrunde liegendes Mehrfachsequenz-Alignment in den Zusatzdaten 1. Hier wurden keine Vorfahren rekonstruiert.

a, Mehrfachsequenz-Alignment von OCP1 aus Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) mit rekonstruierten OCP-Vorfahrensequenzen und entsprechenden alternativen Sequenzen (alt). Wichtige Zustände für die Dimerisierung von OCP1O16, OCP1R29, die Verlangsamung von OCP1 und die Interaktion mit FRP7 sind angegeben, und zwar rot, wenn konserviert, oder blau, wenn nicht. Die Nummerierung der Reste folgt SYNY3 OCP1. Die Regionen der C-terminalen Domäne (CTD), des Linkers und der N-terminalen Domäne (NTD) sind entsprechend gekennzeichnet. Das konservativere angestammte OCP1 (conAncOCP1) und seine alternative Sequenz, die nicht im Haupttext erscheinen, sind ausgegraut. be, Verteilung der A-posteriori-Wahrscheinlichkeiten (pp) pro Standort mit 20 Bin-Kategorien pro rekonstruierter Sequenz, wobei der Mittelwert und die Anzahl der mehrdeutigen Standorte angezeigt werden. Standorte galten als mehrdeutig, wenn pp > 0,2 für den Bundesstaat mit dem zweithöchsten pp und wurden durch die Bundesstaaten in den Alt-Vorfahren ersetzt.

ad, 12 % SDS-Polyacrylamidgele aus angestammten Proteinreinigungen. l, Lysat. ft, durchströmen. w, waschen. e, Elution. -his, nach His-Tag-Spaltung. se, nach Größenausschlusschromatographie. Die Reinigungen wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. eh, UV-Vis-Absorptionsspektren des inaktiven orangen und aktiven roten Zustands der angestammten OCPs. ip, Erholung aus der Photokonversion angestammter OCPs mit (in Molverhältnissen von 5 OCP zu 1 FRP) oder ohne vorhandenes FRP aus Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) wie angegeben bei verschiedenen Temperaturen. qt, Arrhenius-Diagramme der Erholung nach der Photokonversion mit (rot) oder ohne SYNY3 FRP (schwarz). uy, Erholung durch Photokonversion von angestammten OCPs, entweder allein oder mit verschiedenen angestammten FRPs oder angestammten FRPLs oder vorhandenen FRPL von Pseudomonas borbori in unterschiedlichen Molverhältnissen, wie bei 20 °C angegeben, mit entsprechenden mittleren Erholungszeitkonstanten (τ) und SD von drei unabhängigen Replikaten. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt.

ad, 12 % SDS-Polyacrylamidgele alternativer Proteinreinigungen von Vorfahren. l, Lysat. ft, durchströmen. w, waschen. e, Elution. -his, nach His-Tag-Spaltung. se, nach Größenausschlusschromatographie. Die Reinigungen wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. eh, UV-Vis-Absorptionsspektren des inaktiven orangen und aktiven roten Zustands alternativer angestammter OCPs. il, Erholung nach der Photokonversion alternativer angestammter OCPs mit (Cyan) oder ohne (Schwarz) vorhandenem FRP aus Synechocystis sp. PCC 6803 bei 20 °C mit den jeweiligen mittleren Erholungszeitkonstanten (τ) und SD von drei unabhängigen Replikaten. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt. altAncOCPall ist kaum fotoschaltbar.

Phylogenie der ML-Arten mit Felsenstein-Bootstrap-Wahrscheinlichkeiten (FBP) von 100 Replikaten in Kursivschrift. Das Auftreten von FRP- und OCP-Paralogs wird neben der Phylogenie kartiert. Sternchen kennzeichnen Multispezies-Einträge in der BLAST-Datenbank39. Das Ausrufezeichen markiert den einzigen Stamm, dem FRP fehlt, obwohl er über OCP1 verfügt. Grundlegendes Aminosäuresequenz-Alignment in Supplementary Data 1.

a, h + i, 15 % SDS-Polyacrylamidgele von P. borbori, Methylocaldum sp., Desulfobacteriaceae (D) und Chlorobi sp. (C) FRPL nach Größenausschlusschromatographie. Die Reinigungen wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. b: Zirkulardichroismus-Spektren (CD) von P. borbori FRPL (schwarz) in CD-Puffer (grau). c: Native Massenspektrometriedaten von P. borbori FRPL. d, Nanoporen-Sequenzierungsstatistik. e, Wachstumskurve von P. borbori in biologischen Dreifachversuchen mit angezeigten Mittelwerten und Standardabweichung (SD) sowie Bestimmung der Generationszeit (G) während des exponentiellen Wachstums. f, Epi-Fluoreszenzmikroskopie von P. borbori-Stämmen, die entweder keine (WT), nur mVenus (mVenus) oder FRPL-Fusionsproteine ​​mit entweder N- oder C-terminaler mVenus-Fusion exprimieren. Gezeigt wird die integrierte Ganzzellfluoreszenz mit Mittelwert und Standardabweichung, dem Hellfeldbild (BF), dem GFP-Kanalsignal (mVenus) und einer Überlagerung beider (Zusammenführung). Rote Pfeile weisen auf Signalherde an den Zellpolen hin. Der Maßstabsbalken stellt 2 μm dar und gilt für alle Bilder. g: Zweiseitige Welch-t-Tests wurden durchgeführt, um die mittlere integrierte Ganzzellfluoreszenz mit *** p < 0,001, ** p = 0,013, ns, nicht signifikant (p = 0,580) zu vergleichen; n = 28 Zellen pro Bedingung. Die Kästchen erstrecken sich vom unteren zum oberen Interquartilwert der Daten, mit einer Linie am Median. Whisker zeigen Daten innerhalb von ± 1,5 Interquartilbereichen an. Kreise sind Ausreißer. j + k, Wiederherstellung nach Photokonversion von OCP1 aus Synechocystis sp. PCC 6803 mit vorhandener FRPL, wie bei 20 °C angegeben, mit den jeweiligen mittleren Erholungszeitkonstanten (τ) und SD von drei unabhängigen Replikaten. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt.

a, Aminosäuresequenz-Alignment von FRP aus Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) mit vorhandenen und rekonstruierten Vorfahren-FRPLs und Vorfahren-FRPs. Wichtige Stellen für die Homodimerisierung und Interaktion mit OCP1 in FRP sind hervorgehoben7,8 und rot, wenn sie konserviert sind, oder blau, wenn nicht. Die Nummerierung folgt SYNY3 FRP. ML-Bäume für die Rekonstruktionen in der ergänzenden Abbildung 1 + 2. b + c, f + g, Verteilung der A-posteriori-Wahrscheinlichkeiten (pp) pro Standort mit 20 Bin-Kategorien pro rekonstruierter Sequenz mit dem Mittelwert und der Anzahl mehrdeutiger Standorte mit pp > 0,2 für das Bundesland mit dem zweithöchsten angezeigten PP. d + h, 15 % SDS-Polyacrylamidgele von Stammproteinen nach Größenausschlusschromatographie. Die Reinigungen wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. konz., konzentriert. e, Unbewurzelter anfänglicher FRP(L)-Phyllogenesebaum, der zur Rekonstruktion alternativer (Alt-)Vorfahren an angegebenen Knoten verwendet wird. Die Verzweigungslängen stellen die durchschnittlichen Substitutionen pro Standort dar. Vollständiger Baum in der ergänzenden Abbildung 2. HGT, horizontaler Gentransfer. TBE, Bootstrap-Erwartung übertragen. i + j, Erholung aus der Photokonversion von SYNY3 OCP1 mit alternativem angestammtem FRP (altFRPpostHGT) oder alternativem angestammtem FRPL (altFRPLpreHGT), wie angegeben, bei unterschiedlichen Molverhältnissen bei 20 °C mit den jeweiligen mittleren Erholungszeitkonstanten (τ) und SD von drei unabhängigen Replikaten. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden repräsentative Datensätze angezeigt. nd, nicht bestimmbar.

a + b, Pro-Rest-Vertrauensschätzung (pLDDT) der AlphaFold2-Modelle, dargestellt in Abb. 4d+e. c, Konfidenz des vorhergesagten AncOCPall in voller Länge mit den angegebenen Resten in der C-terminalen Domäne (CTD), die an der vorhergesagten Wechselwirkung mit FRP aus Synechocystis sp. beteiligt sind. PCC 6803 (SYNY3), die durch die N-terminale Erweiterung (NTE, in Magenta) im hier vorhergesagten kompakten, orangefarbenen Zustand von AncOCPall blockiert werden. NTD, N-terminale Domäne. d, Vertrauen der modellierten Interaktion zwischen AncOCPall und SYNY3 FRP. z. B. Predicted Alignment Errors (PAE). h + i, AlphaFold2-Modelle der CTD von OCPx aus Gloeobacter kilaueensis JS1 sagen keine Wechselwirkung mit SYNY3 FRP an der erwarteten Schnittstelle voraus (im Einklang mit experimentellen Daten30), es sei denn, Serin (S) an Position 264 (SYNY3-Nummerierung) wird durch Tyrosin (Y) ersetzt ), der angestammte Zustand in AncOCPall, der hier weiter als Overlay angezeigt wird. Einsätze zeigen PAEs.

Ergänzende Abbildungen. 1–3, Tabelle 1 und Diskussion.

Die zugrunde liegenden mehreren Sequenzausrichtungen von Extended Data Abbs. 1, 2 und 6 und ergänzende Abbildungen. 1 und 2.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Steube, N., Moldenhauer, M., Weiland, P. et al. Zufällig kompatible Proteinoberflächen ermöglichten die allosterische Kontrolle beim Lichtschutz von Cyanobakterien. Nat Ecol Evol 7, 756–767 (2023). https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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Eingegangen: 05. September 2022

Angenommen: 21. Februar 2023

Veröffentlicht: 3. April 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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